Primer3 File - http://primer3.sourceforge.net P3_FILE_TYPE=settings P3_FILE_ID=P3 Settings from Lianfu Chen PRIMER_FIRST_BASE_INDEX=1 PRIMER_TASK=generic PRIMER_NUM_RETURN=5 PRIMER_PICK_LEFT_PRIMER=1 PRIMER_PICK_INTERNAL_OLIGO=0 PRIMER_PICK_RIGHT_PRIMER=1 PRIMER_PICK_ANYWAY=1 PRIMER_THERMODYNAMIC_PARAMETERS_PATH=/opt/biosoft/primer3-2.4.0/src/primer3_config/ ### 引物 TM 值设定: ### PRIMER_TM_FORMULA=1 # TM 的计算方法， 1 表示使用 the SantaLucia parameters (Proc Natl Acad Sci 95:1460-65) PRIMER_MIN_TM=55.0 PRIMER_OPT_TM=60.0 PRIMER_MAX_TM=65.0 PRIMER_PAIR_MAX_DIFF_TM=5.0 # 两个引物之间的 TM 值最多相差 5 摄氏度 PRIMER_WT_TM_LT=0 PRIMER_WT_TM_GT=0 PRIMER_PAIR_WT_DIFF_TM=0.0 ### 引物长度设定: ### PRIMER_MIN_SIZE=18 PRIMER_OPT_SIZE=20 PRIMER_MAX_SIZE=22 PRIMER_WT_SIZE_LT=0 PRIMER_WT_SIZE_GT=0 ### 引物 GC 含量设定：### PRIMER_MIN_GC=30.0 PRIMER_MAX_GC=70.0 PRIMER_WT_GC_PERCENT_LT=0.0 PRIMER_WT_GC_PERCENT_GT=0.0 ### 引物的热力学计算: ### # 开启热力学计算，开启后，根据热力学的值 TH 值来计算罚分。 TH 的罚分方法为：罚分系数 * (1 / (引物TM - 4 - TH值))。 # 该方法好处是，TH 值越大，罚分力度越重。 PRIMER_THERMODYNAMIC_OLIGO_ALIGNMENT=1 # 引物自身进行反向互补，罚分系数计算为 9 / ( 1/(60-4-45) - 1/(60-4-0) ) = 123.2 # 这样计算罚分系数的原则是，若 TM 为最佳 60 摄氏度的时候，所允许的最大罚分值减去最小罚分值为 9，和 3' 端碱基的稳定性的罚分额度一致。 PRIMER_MAX_SELF_ANY=8.00 PRIMER_WT_SELF_ANY=0.0 PRIMER_MAX_SELF_ANY_TH=45.00 PRIMER_WT_SELF_ANY_TH=123.2 # 引物自身进行 3' 端反向互补形成引物二聚体，罚分系数计算为 9 / ( 1/(60-4-35) - 1/(60-4-0) ) = 302.4 PRIMER_MAX_SELF_END=3.00 PRIMER_WT_SELF_END=0.0 PRIMER_MAX_SELF_END_TH=35.00 PRIMER_WT_SELF_END_TH=302.4 # left primer 和 right primer 序列的反向互补 PRIMER_PAIR_MAX_COMPL_ANY=8.00 PRIMER_PAIR_WT_COMPL_ANY=0.0 PRIMER_PAIR_MAX_COMPL_ANY_TH=45.00 PRIMER_PAIR_WT_COMPL_ANY_TH=123.2 # left primer 和 right primer 进行 3' 端反向互补形成引物二聚体 PRIMER_PAIR_MAX_COMPL_END=3.00 PRIMER_PAIR_WT_COMPL_END=0.0 PRIMER_PAIR_MAX_COMPL_END_TH=35.00 PRIMER_PAIR_WT_COMPL_END_TH=302.4 # 发夹结构，罚分系数计算为 9 / ( 1/(60-4-24) - 1/(60-4-0) ) = 672 PRIMER_MAX_HAIRPIN_TH=24.00 PRIMER_WT_HAIRPIN_TH=672 # 3' 端碱基的稳定性 PRIMER_MAX_END_STABILITY=9.0 PRIMER_WT_END_STABILITY=1 ### 碱基序列设定： ### PRIMER_LOWERCASE_MASKING=0 # 模板序列中包含小写字符不影响引物设计 PRIMER_MAX_POLY_X=4 # 引物序列中不能包含单核苷酸连续长度超过 4 bp PRIMER_MAX_NS_ACCEPTED=0 # 引物中允许的 N 的数目 PRIMER_WT_NUM_NS=0.0 # 每个 N 的罚分 PRIMER_MAX_END_GC=5 # 引物中 3' 端 5bp 碱基中允许的最大 Gs 或 Cs 的数目 PRIMER_GC_CLAMP=0 # 引物中 3' 端碱基中不能出现连续的 Gs 和 Cs 序列 PRIMER_LIBERAL_BASE=1 # 是否允许有诸如 N A R Y 等类型的碱基。必须在设定PRIMER_MAX_NS_ACCEPTED 不为 0 后方有效。 PRIMER_LIB_AMBIGUITY_CODES_CONSENSUS=0 # 如果设置为 1，则 C 能与 S 完美匹配，任意碱基能和 N 完美匹配。 ### 碱基质量设定： ### PRIMER_MIN_QUALITY=0 # primer 序列允许最小的碱基质量 PRIMER_MIN_END_QUALITY=0 PRIMER_QUALITY_RANGE_MIN=0 PRIMER_QUALITY_RANGE_MAX=100 PRIMER_WT_SEQ_QUAL=0.0 PRIMER_WT_END_QUAL=0.0 ## 引物位置设置： ### PRIMER_SEQUENCING_LEAD=50 # 该参数仅在 PRIMER_TASK=pick_sequencing_primers 时有效. 表明引物的 3' 端距目标区域有 50bp。 PRIMER_SEQUENCING_SPACING=500 # 该参数仅在 PRIMER_TASK=pick_sequencing_primers 时有效. 该值决定了在同一条链上的两个引物的距离. PRIMER_SEQUENCING_INTERVAL=250 # 该参数仅在 PRIMER_TASK=pick_sequencing_primers 时有效. 该值决定了在不同链上的两个引物的距离。 PRIMER_SEQUENCING_ACCURACY=20 # 该参数仅在 PRIMER_TASK=pick_sequencing_primers 时有效. 该值决定了引物设计的区间. PRIMER_OUTSIDE_PENALTY=0 PRIMER_INSIDE_PENALTY=-1.0 PRIMER_WT_POS_PENALTY=0.0 ### 非引物数据库设定：### # 启用非引物数据库 #PRIMER_MISPRIMING_LIBRARY= # 引物比对到非引物数据库 #PRIMER_MAX_LIBRARY_MISPRIMING=12.00 #PRIMER_WT_LIBRARY_MISPRIMING=0.0 #PRIMER_PAIR_MAX_LIBRARY_MISPRIMING=20.00 #PRIMER_PAIR_WT_LIBRARY_MISPRIMING=0.0 # 模板比对到非引物数据库 #PRIMER_MAX_TEMPLATE_MISPRIMING=12.00 #PRIMER_WT_TEMPLATE_MISPRIMING=0.0 #PRIMER_MAX_TEMPLATE_MISPRIMING_TH=40.00 #PRIMER_WT_TEMPLATE_MISPRIMING_TH=0.0 #PRIMER_PAIR_MAX_TEMPLATE_MISPRIMING=24.00 #PRIMER_PAIR_WT_TEMPLATE_MISPRIMING=0.0 #PRIMER_PAIR_MAX_TEMPLATE_MISPRIMING_TH=70.00 #PRIMER_PAIR_WT_TEMPLATE_MISPRIMING_TH=0.0 ### PCR 反应体系设定: ### PRIMER_SALT_MONOVALENT=50.0 # 单价盐离子浓度(mM) PRIMER_SALT_CORRECTIONS=1 # PRIMER_SALT_CORRECTIONS=1 means use the salt correction in SantaLucia et al 1998 PRIMER_SALT_DIVALENT=1.5 # 二价镁离子浓度(mM) PRIMER_DNTP_CONC=0.6 # 总dNTPs浓度(mM) PRIMER_DNA_CONC=50.0 # DNA产物浓度(mM) ### PCR 产物的设定： ### PRIMER_PRODUCT_MIN_TM=-1000000.0 PRIMER_PRODUCT_OPT_TM=0.0 PRIMER_PRODUCT_MAX_TM=1000000.0 PRIMER_PAIR_WT_PRODUCT_TM_LT=0.0 PRIMER_PAIR_WT_PRODUCT_TM_GT=0.0 PRIMER_PRODUCT_OPT_SIZE=0 PRIMER_PAIR_WT_PRODUCT_SIZE_LT=0.0 PRIMER_PAIR_WT_PRODUCT_SIZE_GT=0.0 ## 罚分因子： ### PRIMER_PAIR_WT_PR_PENALTY=1.0 # left primer和right primer的罚分之和。此和乘以此系数，再加其它罚分作为最终罚分。 PRIMER_PAIR_WT_IO_PENALTY=0.0 # 将 internal oligo 的罚分乘以此系数，加入到引物的最终罚分中。 ### internal oligo 的设定：### # TM 值 PRIMER_INTERNAL_MIN_TM=57.0 PRIMER_INTERNAL_OPT_TM=60.0 PRIMER_INTERNAL_MAX_TM=63.0 PRIMER_INTERNAL_WT_TM_LT=1.0 PRIMER_INTERNAL_WT_TM_GT=1.0 # 长度 PRIMER_INTERNAL_MIN_SIZE=18 PRIMER_INTERNAL_OPT_SIZE=20 PRIMER_INTERNAL_MAX_SIZE=27 PRIMER_INTERNAL_WT_SIZE_LT=1.0 PRIMER_INTERNAL_WT_SIZE_GT=1.0 # GC 含量 PRIMER_INTERNAL_MIN_GC=20.0 PRIMER_INTERNAL_MAX_GC=80.0 PRIMER_INTERNAL_OPT_GC_PERCENT=50.0 PRIMER_INTERNAL_WT_GC_PERCENT_LT=0.0 PRIMER_INTERNAL_WT_GC_PERCENT_GT=0.0 # 热力学 PRIMER_INTERNAL_MAX_SELF_ANY=12.00 PRIMER_INTERNAL_WT_SELF_ANY=0.0 PRIMER_INTERNAL_MAX_SELF_END=12.00 PRIMER_INTERNAL_WT_SELF_END=0.0 # 碱基序列 PRIMER_INTERNAL_MAX_POLY_X=5 PRIMER_INTERNAL_MAX_NS_ACCEPTED=0 # 碱基质量 PRIMER_INTERNAL_MIN_QUALITY=0 PRIMER_INTERNAL_WT_END_QUAL=0.0 PRIMER_INTERNAL_WT_SEQ_QUAL=0.0 # 非引物数据库 #PRIMER_INTERNAL_MAX_LIBRARY_MISHYB=12.00 #PRIMER_INTERNAL_WT_LIBRARY_MISHYB=0.0 # PCR 反应体系 PRIMER_INTERNAL_SALT_MONOVALENT=50.0 PRIMER_INTERNAL_SALT_DIVALENT=1.5 PRIMER_INTERNAL_DNA_CONC=50.0 PRIMER_INTERNAL_DNTP_CONC=0.0 =