1. Velvet的安装
Velvet用于基因组的de novo组装，支持各种原始数据，包括Illumina的short reads和454的long reads。
首先下载velvet的安装包，直接使用make命令来编译，即可获得可执行主程序velveth和velvetg。安装如下：
$ wget http://www.ebi.ac.uk/~zerbino/velvet/velvet_1.2.10.tgz $ tar zxf velvet_1.2.10.tgz $ cd velvet_1.2.10 $ make 'CATEGORIES=10' 'MAXKMERLENGTH=57' 'LONGSEQUENCES=1' \ 'OPENMP=1' 'BUNDLEDZLIB=1'
值得注意的是，make后有多种参数，需要对velvet软件进行需要的设置：
CATEGORIES=10： 默认情况下velvet只能输入 2 groups of short reads，此处设置为10. 如果有多个文库或多种类型的原始数据，需要相应增加该值的大小。该值越大，耗内存越大。
MAXKMERLENGTH=57： 最大的Kmer长度，默认情况下该值为 31， 一般de novo组装基因组，31 是不够的，故需要增大该值。组装过程中kmer越大，越耗内存。
BIGASSEMBLY=1： 当超过 2.2G 的reads用于组装基因组的时候，需要设置该值。实际上很少会有如此之多的reads用于基因组组装，可以不用设置该值。设置该值后，会消耗更多的内存。
LONGSEQUENCES=1： 当组装出的contigs长度超过 32kb 长的时候，需要设置该值。会消耗跟多内存。
OPENMP=1：打开多线程运行。需要设置环境变量 OMP_NUM_THREADS 和 OMP_THREAD_LIMIT。 Velvet最多使用 OMP_NUM_THREADS+1 或 OMP_THREAD_LIMIT 个线程。也值哟部分的velvet算法支持多线程运行，不会造成运行时间的线性减少。
BUNDLEDZLIB=1： 默认velvet使用系统自带的zlib，如果系统没有zlib，则需要加入该参数来使用velvet源码包中自带的zlib。
在上述 make 编译完 Velvet 后，继续velvet的使用
2. 使用velveth来准备数据
velveth接受输入的文件，产生一个hash表。生成两个文件：Sequences和Roadmaps。velveth用法为：
$ velveth $ velveth output_directory hash_length \ -file_format -read_type filename1 filename2 ... \ [-file_format -read_type filename1 filename2 ...]
在不带参数情况下，直接运行velveth会给出其帮助文件。而其参数如下：
output_directory：输出文件夹的路径
hash_length： 设置Kmer的大小。该值3点要求：1.必须为奇数；2.必须小于或等于编译velvet时设置的MAXKMERLENGTH值；3.必须小于reads的长度。
file_format： 支持的格式有fasta（默认）、fastq、bam等。
reads_type： short(默认)、shortpaired、short2、shortpaired2 … short10、shortpaired10、long、longPaired。 默认情况下short reads只保留了2个通道。在之前设置中将CATEGORIES值设置为10，则velvet最多支持10种不同类型的short reads数据。long支持长的reads，比如sanger测序数据和454测序数据。 如果reads_type一致，则同一个reads_type下可以有多个文件。
filename1： reads的文件名。如果是成对的reads，则需要将两个reads文件合并成一个文件。Velvet安装文件夹中提供了这样的一个文件。
一个velveth的例子。对5个Illumina测序的结果和一个454测序的结果使用velvet进行组装：
$ velveth output/ 31 \ -shortPaired -fastq fragment1.reads.fastq \ -shortPaired2 -fastq fragment2.reads.fastq \ -shortPaired3 -fastq jumping1.reads.fastq \ -shortPaired4 -fastq jumping2.reads.fastq \ -long -fastq 454.fasta
3. 使用velvetg来进行基因组组装
velvetg是vlevet软件的进行de Bruijin图构建和操作的核心。在命令行下直接键入命令velvetg，这样描述：velvetg – de Bruijn graph construction, error removal and repeat resolution。其使用方法如下：
$ velvetg $ velvetg directory [options] $ velvetg output -exp_cov auto -cov_cutoff auto \ -shortMatePaired3 yes -shortMatePaired4 yes \ -clean yes -scaffolding yes -amos_file yes
velvetg的具体参数如下：
directory 工作的目录名，即为上一步骤velveth中的输出文件夹。
-cov_cutoff <float|auto> default： no removal
设置最低kmer覆盖度的值。默认下会生成很多nodes，而有些nodes很短，覆盖度较低，需要去除掉。auto则自动设置该值，是该值为所有nodes的kmer覆盖度值的median值的1/2。
-exp_cov <float|auto> default： no long or paired-end read resolution。
期望的kmer覆盖度。如果设置了auto，则该值为所有nodes的kmer覆盖度值的median值; 该值设置为auto，则同时自动设置-cov_cutoff为auto。如果对杂合基因组进行组装时，设置auto，却很难进行预测，组装结果肯定不好。auto适用于标准的基因组测序。
-long_cov_cutoff <float> default： no removal
移除低long-read覆盖度的nodes。
-ins_length <interger>
成对的short reads间的distance的期望值，即插入片段的平均长度。
-ins_length* <interger>
*代表第*组shortPaired reads, 和 velveth 中的参数相对应。
-ins_length_long <interger>
和前两个参数一样，代表longPaired reads的插入片段长度。
-ins_length*_sd <interger>
此时’*’代表’nothing、2、3…、long’等，和上面的3个参数相匹配；该值设置插入片段长度的标准差。有关插入片段长度和sd的如果不设置，velvet则会自动计算。velvet是将成对的reads比对到组装出来的nodes上，最后计算出一个insert size 和sd。这样做的话，可能估算的不准确，需要看velvet的运行输出信息，检测其预算是否准确。
-scaffolding <yes|no> defautl: yes
是否要使用paired end信息进行scaffolds组装
-max_branch_length <integer> default: 100
处理气泡(bubble)的参数。默认下，如果两条序列超过了100bp的位点处的kmer不一致，则将这两条序列分开成单独的contigs。
-max_divergence <float> default: 0.2
在一个bubble内两条branches最大的差异率（分母为较长的branch的长度）。
-max_gap_count <integer> default: 3
在一个bubble内两条branches比对结果中，运行的最大gap数。该参数和上两个参数为重要的参数，能很大程度上影响组装结果。如果设置得松点，可分别将值设为200,0.33,5。
-min_pair_count <integer> default: 5
默认，将两个contigs连成scaffold最少需要5对paired reads的验证。如果测序深度较大，则可以提高该值；测序深度低，则降低该值。
-long_mult_cutoff <integer> default: 2
默认下，融合两个contigs需要最少有2个long reads验证。
-max_coverage <float> default: no removal
最高的覆盖度，高于此覆盖度的nodes将被删除。
-coverage_mask <integer> default: 1
contigs最小的置信覆盖度，低于此覆盖度的contigs被maksed。
-shortMatePaired* <yes|no> default: no
如果哪一个shortPaired为mate-pair library测序的结果，则需要指定该参数为yes。
-conserveLong <yes|no> default: no
是否保留含有long reads的序列
-unused_reads <yes|no> default: no
是否输出unused reads, 保存到 UnusedReads.fa 中。
-alignments <yes|no> default: no
是否输出contig比对到参考序列的summary.
-exportFiltered <yes|no> default: no
是否输出由于覆盖度的原因被过滤掉的long nodes。
-clean <yes|no> default: no
是否删除所有的不能用于重新计算的中间文件
-very_clean <yes|no> default: no
是否删除所有的中间文件（删除后不能重新计算）
-min_contig_lgth <integer> default: hash length * 2
输出结果中最小的contigs长度
-amos_file <yes|no> default: no
是否输出AMOS文件
velvetg的默认输出结果
directory/contigs.fa 长度2倍长于kmer的contigs。参数-scaffolding决定生成的该fasta文件是否包含scaffold序列。
directory/stats.txt 用于决定覆盖度cutoff的统计表
directory/PreGraph 初始的de vruijin图
directory/Graph2 最终的de bruijin图 关于该文件中内容的解释，请见velvet PDF manual。
directory/velvet_asm.afg AMOS兼容的组装文件，能用于AMOS基因组组装软件包
directory/Log velvet的运行记录
4. Velvet提供了额外的一些scripts
这些scripts非常有用，位于$velvetHome/contrib/文件夹下。
4.1 estimate-exp_cov
在使用velvetg组装出一个初步结果后，利用结果文件stats.txt来估算出kmer的期望覆盖度。
$ $velvetHome/contrib/estimate-exp_cov/velvet-estimate-exp_cov.pl \ [options] stats.txt
4.2 observed-insert-length.pl
在使用velvetg组装出一个初步结果后，以结果文件夹为输入，计算insert size和insert sd。
$ $velvetHome/contrib/observed-insert-length.pl/observed-insert-length.pl \ [options] Velvet_directory
4.3 shuffleSequences
将对称的reads1和reads2文件合并成一个文件，用于velvet的输入。velvet不能将两个文件用于输入。
$ $velvetHome/contrib/shuffleSequences_fasta/shuffleSequences_fastq.pl \ reads1.fastq reads2.fastq reads.fastq
4.4 VelvetOptimiser
输入该脚本的命令，不加参数，给出详细的帮助信息。该程序用于选取不同的Kmer值，来对原始数据进行组装，同时计算出最优化的组装参数。最后给出最优化方案的组装结果。非常适合于简单基因组的自动化组装操作。其参数设置较为简单。当然需要能在$PATH中有velveth和velvetg两个主要的velvet命令。以下就不详细介绍该命令参数，仅给出一个例子:
$ $velvetHome/contrib/VelvetOptimiser-2.2.4/VelvetOptimiser.pl \ --s 17 --e 97 --x 2 --a --t 4 --k 'n50' --c 'Lbp' \ --f '-shortPaired -fastq fragment1.reads.fastq \ -shortPaired2 -fastq fragment2.reads.fastq \ -shortPaired3 -fastq jumping1.reads.fastq \ -shortPaired4 -fastq jumping2.reads.fastq \ -long -fastq 454.fasta' \ -o 'shortMatePaired3 yes shortMatePaired4 yes' \ [-g 40M]
以上命令意义为：使用kmer长度从17到97，每次运行kmer长度+2； –a表示要生成amosfile；使用N50来决定kmer的选取；以’Lbp’,即大于1kb的contigs的总碱基数来决定coverage cutoff的值的选取；–f后为velveth的参数；–o后接velvetg的参数；-g后为预计的基因组大小，用于计算该命令下内存的消耗，然后退出运行，由于该程序会同时运行多个velvet和velveg，消耗的内存巨大。
4.5 AssemblyAssembler
该程序能使用不同的kmer组装出很多Assemblies，然后将这些Assemblies组装融合出一个最终的结果。其使用方法位于该程序的通目录下的README文本文件中。给出一个例子如下：
$ $velvetHome/contrib/AssemblyAssembler1.3/AssemblyAssembler1.3.py \ -s 17 -e 99 -v $velvetHome -c 5.1 -t 35 -i 300 -m 51 -r y \ -f "-fastq -shortPaired reads.fastq"
以上命令意义为：使用从17到99的kmer，每种kmer都组装出基因组并最后合并成一个结果。-c为coverage cutoff值；-t设置为只有大于35的kmer时，才进行coverage cutoff；-i表示插入片段长度为300；-m表示期望的kmer覆盖度为51；-r表示结果给出short reads要包含到最后的组装结果中。
可以看出该程序适合于只有一种类型的short reads时，才适合。因为其参数-i只能设置一种插入片段长度大小。
4.6 其它程序
extractContigReads用于提取和指定conting相对应的reads；
afg_handing 用于检查 .afg 文件；
fasta2agp 用于将fasta格式的基因组组装结果(gaps用N表示)转换成AGP文件，用于提交到EMBL或NCBI；
show_repeats 指出Assembly中larger repeated contigs的长度；
read_prepare 和 select_paired 用于NGS数据的过滤