1. HTSeq简介

HTSeq是使用Python编写的一支用于进行基因Count表达量分析的软件，能根据SAM/BAM比对结果文件和基因结构注释GTF文件得到基因水平的Counts表达量。HTSeq进行Counts计算的原理非常简单易懂，容易上手。

2. HTSeq安装

在PYPI下载HTSeq的Python包
$ wget https://pypi.python.org/packages/46/f7/6105848893b1d280692eac4f4f3c08ed7f424cec636aeda66b50bbcf217e/HTSeq-0.7.2.tar.gz
$ tar zxf HTSeq-0.7.2.tar.gz
$ cd HTSeq-0.7.2
$ /opt/sysoft/Python-2.7.11/bin/python setup.py build
$ /opt/sysoft/Python-2.7.11/bin/python setup.py install
$ cd ../ && rm HTSeq-0.7.2 -rf

3. HTSeq使用

3.1 HTSeq的Count模式

HTSeq计算counts数有3种模式，如下图所示（ambiguous表示该read比对到多个gene上；no_feature表示read没有比对到gene上）：

3.2 HTSeq的使用命令

HTseq安装完毕后，在Python软件的bin目录下生成htseq-count命令。
htseq-count运行简单示例：

对于非链特异性真核转录组测序数据
$ /opt/sysoft/Python-2.7.11/bin/htseq-count -f sam -r name -s no -a 10 -t exon -i gene_id -m union hisat2.sam genome.gtf > counts_out.txt
对于链特异性测序真核转录组测序数据
$ /opt/sysoft/Python-2.7.11/bin/htseq-count -f sam -r name -s reverse -a 10 -t exon -i gene_id -m union hisat2.sam genome.gtf > counts_out.txt
对于非链特异性原核生物转录组测序数据
$ /opt/sysoft/Python-2.7.11/bin/htseq-count -f sam -r name -s no -a 10 -t exon -i gene_id -m intersection-strict bowtie2.sam genome.gtf > counts_out.txt

htseq-count命令的常用参数：

-f | --format     default: sam
  设置输入文件的格式，该参数的值可以是sam或bam。
-r | --order     default: name
  设置sam或bam文件的排序方式，该参数的值可以是name或pos。前者表示按read名进行排序，后者表示按比对的参考基因组位置进行排序。若测序数据是双末端测序，当输入sam/bam文件是按pos方式排序的时候，两端reads的比对结果在sam/bam文件中一般不是紧邻的两行，程序会将reads对的第一个比对结果放入内存，直到读取到另一端read的比对结果。因此，选择pos可能会导致程序使用较多的内存，它也适合于未排序的sam/bam文件。而pos排序则表示程序认为双末端测序的reads比对结果在紧邻的两行上，也适合于单端测序的比对结果。很多其它表达量分析软件要求输入的sam/bam文件是按pos排序的，但HTSeq推荐使用name排序，且一般比对软件的默认输出结果也是按name进行排序的。
-s | --stranded     default: yes
  设置是否是链特异性测序。该参数的值可以是yes,no或reverse。no表示非链特异性测序；若是单端测序，yes表示read比对到了基因的正义链上；若是双末端测序，yes表示read1比对到了基因正义链上，read2比对到基因负义链上；reverse表示双末端测序情况下与yes值相反的结果。根据说明文件的理解，一般情况下双末端链特异性测序，该参数的值应该选择reverse（本人暂时没有测试该参数）。
-a | --a     default: 10
  忽略比对质量低于此值的比对结果。在0.5.4版本以前该参数默认值是0。
-t | --type     default: exon
  程序会对该指定的feature（gtf/gff文件第三列）进行表达量计算，而gtf/gff文件中其它的feature都会被忽略。
-i | --idattr     default: gene_id
  设置feature ID是由gtf/gff文件第9列那个标签决定的；若gtf/gff文件多行具有相同的feature ID，则它们来自同一个feature，程序会计算这些features的表达量之和赋给相应的feature ID。
-m | --mode     default: union
  设置表达量计算模式。该参数的值可以有union, intersection-strict and intersection-nonempty。这三种模式的选择请见上面对这3种模式的示意图。从图中可知，对于原核生物，推荐使用intersection-strict模式；对于真核生物，推荐使用union模式。
-o | --samout 
  输出一个sam文件，该sam文件的比对结果中多了一个XF标签，表示该read比对到了某个feature上。
-q | --quiet
  不输出程序运行的状态信息和警告信息。
-h | --help
  输出帮助信息。

3.3 HTSeq使用注意事项

HTSeq的使用有如下注意事项，否则得到的结果是错误的：

1. HTSeq是对有参考基因组的转录组测序数据进行表达量分析的，其输入文件必须有SAM和GTF文件。
2. 一般情况下HTSeq得到的Counts结果会用于下一步不同样品间的基因表达量差异分析，而不是一个样品内部基因的表达量比较。因此，HTSeq设置了-a参数的默认值10，来忽略掉比对到多个位置的reads信息，其结果有利于后续的差异分析。
3. 输入的GTF文件中不能包含可变剪接信息，否则HTSeq会认为每个可变剪接都是单独的基因，导致能比对到多个可变剪接转录本上的reads的计算结果是ambiguous，从而不能计算到基因的count中。即使设置-i参数的值为transcript_id，其结果一样是不准确的，只是得到transcripts的表达量。

3.4 HTSeq的结果

HTSeq将Count结果输出到标准输出，其结果示例如下：

gene00001	0
gene00002	9224
gene00003	880
...
gene12300	1043
gene12301	200
__no_feature	127060
__ambiguous	0
__too_low_aQual	4951
__not_aligned	206135
__alignment_not_unique	0