一. Tophat简介

Tophat使用RNA-seq的reads数据来寻找基因的剪切点(splice junction）。该软件调用Bowtie,或Bowtie2来将reads比对到参考基因组上，分析比对结果，从而寻找出外显子之间的结合位点。

二. Tophat安装

直接下载适合于Linux x86_64的二进制文件，解压缩即可使用。

$ wget http://tophat.cbcb.umd.edu/downloads/tophat-2.0.8b.Linux_x86_64.tar.gz
$ tar zxf tophat-2.0.8b.Linux_x86_64.tar.gz

前提条件当然要安装Bowtie, Bowtie2, SAM tools, Boost C++ libraries等。

三. Tophat的使用参数

使用Tohat时，bowtie2（或bowtie，下同）, bowtie2-align, bowtie2-inspect, bowtie2-build 和 samtools 必须要在系统路径中。

1. 用法

$ tophat [options]* <index_base> <reads1_1[,...,readsN_1]> <reads1_2[,...,readsN_2]>
可以看出，tophat必须要的条件是比对的index数据库，以及要比对的reads。可以为多个
paired-end reads数据以逗号分开。

值得注意的：Tophat能比对的最大reads为1024bp； 能比对paired-end reads； 不能将多种不同类型的reads混合起来进行比对，这样会给出不好的结果。

如果有多种不同类型的reads进行比对，则可以：

首先，对一种类型的reads使用合适的参数运行tophat；
接着，使用bed_to_juncs将前一次的运行结果junctions.bed转换成下一次运行tophat
所的-j参数所需的junction文件；
最后，再一次使用-j参数运行tophat。

2. 常用一般参数

-h | --help
-v | --version

-N | --read-mismatches  default: 2
    丢弃不匹配碱基数超过该数目的比对结果

--read-gap-length  default: 2
    丢弃gap总长度超过该数目的比对结果

--read-edit-dist  default: 2
    丢弃read的edit distance大于该值的比对结果

--read-realign-edit-dist <int> default: "read-edit-dist" + 1
    一些跨越多个exons的reads可能会被错误地比对到geneome上。Tophat有多个比对
步骤，每个比对步骤过后，比对结果中包含了edit distance的值。该参数能让Tophat对
那些edit distance的值 >= 该参数的reads重新进行比对。若设置该参数值为0，则每个
read在多个比对步骤中每次都要进行比对。这样会加大地增加比对精确性和运行时间。默认下
该参数比上一个参数的值大，则表示对reads进行重新比对。

--bowtie1  default: bowtie2
    使用Bowtie1来代替Bowtie2进行比对。特别是使用colorspace reads时，因为只
有Bowtie1支持，而Bowtie2不支持。

-o | --output <string>  default: ./tophat_out
    输出的文件夹路径

-r | --mate-inner-dist <int>  default: 50
    成对的reads之间的平均inner距离。例如：fragments长度300bp，reads长度50bp
， 则其inner距离为200bp，该值该设为200。

--mate-std-dev <int>  default:20
    inner距离的标准偏差。

-a | --min-anchor-length <int>  default: 8
    read的锚定长度：该参数能设定的最小值为3；锚定在junction两边的reads长度只
有都大于此值，才能用于junction的验证。

-m | --splice-mismatches <int>  default: 0
    对于一个剪切比对，其在锚定区能出现的最大的不匹配碱基数。

-i | --min-intron-length <int>  default:70
    最小的intron长度。Tophat会忽略比该长度要小的donor/acceptor pairs，认
为该区属于exon。

--I | --max-intron-length <int>  default:500000
    最大的intron长度。Tophat会忽略长度大于该值的donor/acceptor pairs，除
非有long read支持。

--max-insertion-length <int>  defautl: 3
    最大的插入长度

--max-deletion-length <int>  default: 3
    最大的缺失长度

--solexa-quals
    fastq文件使用Solexa的碱基质量格式

--solexa1.3-quals | --phred64-quals
    使用Illumina GA pipeline version 1.3的碱基质量格式，即Phred64.

-Q | --quals
    说明是使用单独的碱基质量文件

--inter-quals
    有空格隔开的整数值来代表碱基质量。当使用 -C 参数时，该参数为默认参数。

-C | --color
    Colorspace reads。使用这一种reads的时候命令如下：
$ tophat --color --quals --bowtie1 [other options]* <colorspac
e_index_base> <reads1_1[,...,readsN_1]> <reads2_1[,...,readN_2]>
 <quals1_1[,...,qualsN_1]> <quals1_2[,...,qualsN_2]>

-p | --num-threads <int>  default: 1
    比对reads的线程数

-g | --max-multihits <int>  default: 20
    对于一个reads，可能会有多个比对结果，但tophat根据比对得分，最多保留的比对结
果数目。如果没有 --report-secondary-alignments 参数，则只会报告出最佳的比对
结果。若最佳比对结果数目超过该参数值，则只随机报告出该数目的最佳比对结果；若有 --
report-secondary-alignments 参数，则按得分顺序报告出比对结果，直至达到默认
的数目为止。

--report-secondary-alignments
    是否报告additional or secondary alignments（基于比对分值AS来确定的）。

--no-discordant
    对于paired reads，仅仅报告concordant mappings。

--no-mixed
    对于paired reads，只报告concordant mappings 和 discordant mappi
ngs。默认上，是所有的比对结果都报告。

--no-coverage-search
    取消以覆盖度为基础来搜寻junctions，和下一个参数对立，该参数为默认参数。
--coverage-search
    确定以覆盖度为基础来搜寻junctions。该参数能增大敏感性。

--microexon-search
    使用该参数，pipeline会尝试寻找micro-exons。仅仅在reads长度>=50bp时有效。

--library-type
    Tophat处理的reads具有链特异性。比对结果中将会有个XS标签。一般Illumina数
据的library-type为 fr-unstranded。

3. 高级参数

 --keep-tmp
    保留中间文件和临时文件，对于debug有用

--keep-fasta-order
    对比对结果按基因组fasta文件进行排序。该参数会使输出的SAM/BAM文件和tophat的
1.41或以前版本不兼容

--no-sort-bam
    输出的BAM文件不是coordinate-sorted.

--no-convert-bam
    不要转换成bam格式。输出结果为sam格式。

-R | --resume <string>
    从最末尾的成功完成点处，接着运行Tophat。使用方法为：
$ tophat -R tophat_out

-z | --zpacker  default:gzip
    用来对临时文件进行压缩的的压缩程序

4. Bowtie2的特别参数

使用tophat2的时候，其中的一些参数传递为bowtie2的参数，这些参数都以’b2’开头。其实，这些参数使用默认的即可。

end-to-end模式(Tophat2不能使用local alignment):
--b2-very-fast
--b2-fast
--b2-sensitive
--b2-very-sensitive

比对参数：
--b2-N  default: 0
--b2-L  default: 20
--b2-i  default: S,1,1.25
--b2-n-ceil  default: L,0,0.15
--b2-gbar  defaut: 4

得分参数：
--b2-mp  default: 6,2
--b2-np  default: 1
--b2-rdg  default: 5,3
--b2-rfg  default: 5,3
--b2-score-min  default: L,-0.6,-0.6

Effort参数
--b2-D  default: 15
--b2-R  default: 2

5. 融合转录子mapping

如果设定 –fusion-search 参数，则有些reads能比对到潜在的融合转录子(fusion transcripts)上。额外融合信息保存在 fusions.out 中。

--fusion-search 
    开启融合转录子的比对
--fusion-anchor-length  default: 20
    read比对到融合子的两边，每以边至少匹配的碱基数。

6. 提供的转录子的结构注释数据

值得注意的提供的GTF文中中的染色体名称和Bowtie index中的一致。这些名称是区分大小写的。

-j | --raw-juncs <.juncs file>
    提供junctions文件。该文件可以使用tophat同一目录下的程序bed_to_juncs程序
来处理tophat的结果文件junctions.bed生成。
$ bed_to_juncs <junctions.bed>
    junctions文件是tab分隔的文件，内容为：
<chrom> <leftgt> <rigth> <+/->
其中left和right数值是0-based的junction两端的值。

--no-novel-juncs
只搜寻和GFF或junctions文件中提供的junctions想匹配的reads。如果没有 -G 或 -j
 参数，则该参数无效。

-G | --GTF <GTF/GFF3 file>
提供基因模型的注释文件，GTF 2.2 或者 GFF 3 格式的文件。如果设置了该参数，Tophat
则先提取出转录子序列，然后使用Bowtie2将reads比对到提取的转录组中；只有不能比对上
的reads再比对到genome；比对上的reads再打断转变成genomic mappings；再融合新
的mappings和junctions作为最后的输出。
值得注意的是GTF/GFF文件代表chromosome和contig的第一列要和bowtie index中的
参考序列名一致。 `$ bowtie-inspect --names your_index` 命令可以获得bowt
ie的index。

--transcriptome-index <dir/prefix>
是使用了 -G 参数后，Tophat提取转录子序列，然后使用bowtie2-build来建立index，
这个过程会消耗不少时间。于是，使用该参数，会将index文件生成到指定文件夹。则后续的
运用同样的index则不再需要额外耗时了。

7. 提供insertions/deletions

以下参数是使用RNA-seq数据来验证indels。

--insertions | --deletions <.juncs file>
    juncs文件例子：
chr1 20564 20567
0-based数值。表示有20565和20566这2个碱基缺失
chr1 17491 17491 CA
表示在17491处插入了2个碱基CA

--no-novel-indels
    仅仅只搜寻在已给的位点的reads。

四. Tophat的输出结果

主要的结果文件是：
1. accepted_hits.bam
2. junctions.bed UCSC BED格式
3. insertions.bed 和 deletions.bed

五. 思考题

对一物种的两个样本A和B使用Illumina Hiseq2000分别进行了转录组测序，得到了结果文件A.reads1_1.fastq, A.reads1_2.fastq, B.reads1_1.fastq 和 B.reads1_2fastq。测序文库的插入片段长度为200bp，reads长度为90bp。物种的基因组文件为species.fasta。请用Tophat分析该物种的转录结合位点，indel信息?

$ bowtie2-build species.fastq species
$ tophat \
  --read-realign-edit-dist 0 \
  -o ./tophat_out \
  -r 20 \
  --mate-std-dev 20 \
  --coverage-search \
  --microexon-search \
  -p 24 \
  --library-type fr-unstranded \
  species \
  A.reads1_1.fastq,B.reads1_1.fastq A.reads1_2.fastq B.reads1_2fastq