Tophat的安装与使用

一. Tophat简介

Tophat使用RNA-seq的reads数据来寻找基因的剪切点(splice junction)。该软件调用Bowtie,或Bowtie2来将reads比对到参考基因组上,分析比对结果,从而寻找出外显子之间的结合位点。

二. Tophat安装

直接下载适合于Linux x86_64的二进制文件,解压缩即可使用。

$ wget http://tophat.cbcb.umd.edu/downloads/tophat-2.0.8b.Linux_x86_64.tar.gz
$ tar zxf tophat-2.0.8b.Linux_x86_64.tar.gz

前提条件当然要安装Bowtie, Bowtie2, SAM tools, Boost C++ libraries等。

三. Tophat的使用参数

使用Tohat时,bowtie2(或bowtie,下同), bowtie2-align, bowtie2-inspect, bowtie2-build 和 samtools 必须要在系统路径中。

1. 用法

$ tophat [options]* <index_base> <reads1_1[,...,readsN_1]> <reads1_2[,...,readsN_2]>
可以看出,tophat必须要的条件是比对的index数据库,以及要比对的reads。可以为多个
paired-end reads数据以逗号分开。

值得注意的:Tophat能比对的最大reads为1024bp; 能比对paired-end reads; 不能将多种不同类型的reads混合起来进行比对,这样会给出不好的结果。

如果有多种不同类型的reads进行比对,则可以:

首先,对一种类型的reads使用合适的参数运行tophat;
接着,使用bed_to_juncs将前一次的运行结果junctions.bed转换成下一次运行tophat
所的-j参数所需的junction文件;
最后,再一次使用-j参数运行tophat。

2. 常用一般参数

-h | --help
-v | --version

-N | --read-mismatches  default: 2
    丢弃不匹配碱基数超过该数目的比对结果

--read-gap-length  default: 2
    丢弃gap总长度超过该数目的比对结果

--read-edit-dist  default: 2
    丢弃read的edit distance大于该值的比对结果

--read-realign-edit-dist <int> default: "read-edit-dist" + 1
    一些跨越多个exons的reads可能会被错误地比对到geneome上。Tophat有多个比对
步骤,每个比对步骤过后,比对结果中包含了edit distance的值。该参数能让Tophat对
那些edit distance的值 >= 该参数的reads重新进行比对。若设置该参数值为0,则每个
read在多个比对步骤中每次都要进行比对。这样会加大地增加比对精确性和运行时间。默认下
该参数比上一个参数的值大,则表示对reads进行重新比对。

--bowtie1  default: bowtie2
    使用Bowtie1来代替Bowtie2进行比对。特别是使用colorspace reads时,因为只
有Bowtie1支持,而Bowtie2不支持。

-o | --output <string>  default: ./tophat_out
    输出的文件夹路径

-r | --mate-inner-dist <int>  default: 50
    成对的reads之间的平均inner距离。例如:fragments长度300bp,reads长度50bp
, 则其inner距离为200bp,该值该设为200。

--mate-std-dev <int>  default:20
    inner距离的标准偏差。

-a | --min-anchor-length <int>  default: 8
    read的锚定长度:该参数能设定的最小值为3;锚定在junction两边的reads长度只
有都大于此值,才能用于junction的验证。

-m | --splice-mismatches <int>  default: 0
    对于一个剪切比对,其在锚定区能出现的最大的不匹配碱基数。

-i | --min-intron-length <int>  default:70
    最小的intron长度。Tophat会忽略比该长度要小的donor/acceptor pairs,认
为该区属于exon。

--I | --max-intron-length <int>  default:500000
    最大的intron长度。Tophat会忽略长度大于该值的donor/acceptor pairs,除
非有long read支持。

--max-insertion-length <int>  defautl: 3
    最大的插入长度

--max-deletion-length <int>  default: 3
    最大的缺失长度

--solexa-quals
    fastq文件使用Solexa的碱基质量格式

--solexa1.3-quals | --phred64-quals
    使用Illumina GA pipeline version 1.3的碱基质量格式,即Phred64.

-Q | --quals
    说明是使用单独的碱基质量文件

--inter-quals
    有空格隔开的整数值来代表碱基质量。当使用 -C 参数时,该参数为默认参数。

-C | --color
    Colorspace reads。使用这一种reads的时候命令如下:
$ tophat --color --quals --bowtie1 [other options]* <colorspac
e_index_base> <reads1_1[,...,readsN_1]> <reads2_1[,...,readN_2]>
 <quals1_1[,...,qualsN_1]> <quals1_2[,...,qualsN_2]>

-p | --num-threads <int>  default: 1
    比对reads的线程数

-g | --max-multihits <int>  default: 20
    对于一个reads,可能会有多个比对结果,但tophat根据比对得分,最多保留的比对结
果数目。如果没有 --report-secondary-alignments 参数,则只会报告出最佳的比对
结果。若最佳比对结果数目超过该参数值,则只随机报告出该数目的最佳比对结果;若有 --
report-secondary-alignments 参数,则按得分顺序报告出比对结果,直至达到默认
的数目为止。

--report-secondary-alignments
    是否报告additional or secondary alignments(基于比对分值AS来确定的)。

--no-discordant
    对于paired reads,仅仅报告concordant mappings。

--no-mixed
    对于paired reads,只报告concordant mappings 和 discordant mappi
ngs。默认上,是所有的比对结果都报告。

--no-coverage-search
    取消以覆盖度为基础来搜寻junctions,和下一个参数对立,该参数为默认参数。
--coverage-search
    确定以覆盖度为基础来搜寻junctions。该参数能增大敏感性。

--microexon-search
    使用该参数,pipeline会尝试寻找micro-exons。仅仅在reads长度>=50bp时有效。

--library-type
    Tophat处理的reads具有链特异性。比对结果中将会有个XS标签。一般Illumina数
据的library-type为 fr-unstranded。

3. 高级参数

 --keep-tmp
    保留中间文件和临时文件,对于debug有用

--keep-fasta-order
    对比对结果按基因组fasta文件进行排序。该参数会使输出的SAM/BAM文件和tophat的
1.41或以前版本不兼容

--no-sort-bam
    输出的BAM文件不是coordinate-sorted.

--no-convert-bam
    不要转换成bam格式。输出结果为sam格式。

-R | --resume <string>
    从最末尾的成功完成点处,接着运行Tophat。使用方法为:
$ tophat -R tophat_out

-z | --zpacker  default:gzip
    用来对临时文件进行压缩的的压缩程序

4. Bowtie2的特别参数

使用tophat2的时候,其中的一些参数传递为bowtie2的参数,这些参数都以’b2’开头。其实,这些参数使用默认的即可。

end-to-end模式(Tophat2不能使用local alignment):
--b2-very-fast
--b2-fast
--b2-sensitive
--b2-very-sensitive

比对参数:
--b2-N  default: 0
--b2-L  default: 20
--b2-i  default: S,1,1.25
--b2-n-ceil  default: L,0,0.15
--b2-gbar  defaut: 4

得分参数:
--b2-mp  default: 6,2
--b2-np  default: 1
--b2-rdg  default: 5,3
--b2-rfg  default: 5,3
--b2-score-min  default: L,-0.6,-0.6

Effort参数
--b2-D  default: 15
--b2-R  default: 2

5. 融合转录子mapping

如果设定 –fusion-search 参数,则有些reads能比对到潜在的融合转录子(fusion transcripts)上。额外融合信息保存在 fusions.out 中。

--fusion-search 
    开启融合转录子的比对
--fusion-anchor-length  default: 20
    read比对到融合子的两边,每以边至少匹配的碱基数。

6. 提供的转录子的结构注释数据

值得注意的提供的GTF文中中的染色体名称和Bowtie index中的一致。这些名称是区分大小写的。

-j | --raw-juncs <.juncs file>
    提供junctions文件。该文件可以使用tophat同一目录下的程序bed_to_juncs程序
来处理tophat的结果文件junctions.bed生成。
$ bed_to_juncs <junctions.bed>
    junctions文件是tab分隔的文件,内容为:
<chrom> <leftgt> <rigth> <+/->
其中left和right数值是0-based的junction两端的值。

--no-novel-juncs
只搜寻和GFF或junctions文件中提供的junctions想匹配的reads。如果没有 -G 或 -j
 参数,则该参数无效。

-G | --GTF <GTF/GFF3 file>
提供基因模型的注释文件,GTF 2.2 或者 GFF 3 格式的文件。如果设置了该参数,Tophat
则先提取出转录子序列,然后使用Bowtie2将reads比对到提取的转录组中;只有不能比对上
的reads再比对到genome;比对上的reads再打断转变成genomic mappings;再融合新
的mappings和junctions作为最后的输出。
值得注意的是GTF/GFF文件代表chromosome和contig的第一列要和bowtie index中的
参考序列名一致。 `$ bowtie-inspect --names your_index` 命令可以获得bowt
ie的index。

--transcriptome-index <dir/prefix>
是使用了 -G 参数后,Tophat提取转录子序列,然后使用bowtie2-build来建立index,
这个过程会消耗不少时间。于是,使用该参数,会将index文件生成到指定文件夹。则后续的
运用同样的index则不再需要额外耗时了。

7. 提供insertions/deletions

以下参数是使用RNA-seq数据来验证indels。

--insertions | --deletions <.juncs file>
    juncs文件例子:
chr1 20564 20567
0-based数值。表示有20565和20566这2个碱基缺失
chr1 17491 17491 CA
表示在17491处插入了2个碱基CA

--no-novel-indels
    仅仅只搜寻在已给的位点的reads。

四. Tophat的输出结果

主要的结果文件是:
1. accepted_hits.bam
2. junctions.bed UCSC BED格式
3. insertions.bed 和 deletions.bed

五. 思考题

对一物种的两个样本A和B使用Illumina Hiseq2000分别进行了转录组测序,得到了结果文件A.reads1_1.fastq, A.reads1_2.fastq, B.reads1_1.fastq 和 B.reads1_2fastq。测序文库的插入片段长度为200bp,reads长度为90bp。物种的基因组文件为species.fasta。请用Tophat分析该物种的转录结合位点,indel信息?

$ bowtie2-build species.fastq species
$ tophat \
  --read-realign-edit-dist 0 \
  -o ./tophat_out \
  -r 20 \
  --mate-std-dev 20 \
  --coverage-search \
  --microexon-search \
  -p 24 \
  --library-type fr-unstranded \
  species \
  A.reads1_1.fastq,B.reads1_1.fastq A.reads1_2.fastq B.reads1_2fastq

Tophat的安装与使用》上有10个想法

  1. 您好,我将bowtiebowtie2-2.1.0安装好后,在终端中运行,提示Error: Expected bowtie2 to be in same directory with bowtie2-align:/usr/local/bin/ at /usr/local/bin/bowtie2 line 59.
    这是什么原因啊?非常感谢您能帮我解答下

    • 根据你的错误提示信息,说明安装bowtie不对。你使用命令 “ which bowtie2” 看下,你正真使用的 bowtie2 命令的位置。而在这个bowtie2命令的同目录下没有 bowtie2-align 这个命令,于是造成了上述错误提示。

      bowtie2其实是调用了同目录下的bowtie2-align命令进行序列比对的。

  2. 您好!请问用tophat得到的junction.bed, deletion.bed, insertuon.bed有什么快速高量的办法来统计整个的情况吗?比如有多少junction, 哪些位置是富集的 etc.

  3. 我想请问一下用tophat运行单末端测序文件数据,需要注意什么?还有想利用这单末端测序的数据分析基因差异表达应该用怎么样的流程?希望楼主尽快解答我的问题,先谢谢了

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