只根据两个转录组数据分析差异表达基因

1. 数据

手头有两个转录组数据,分别是某一真菌物种(该物种没有基因组数据)的双核菌丝阶段和子实体阶段的转录组数据。测序平台是Illumina Hiseq2000;插入片段长度200bp,测序的reads长度90bp。得到的数据文件为:

/home/user/RNA-seq/mycelium_reads1.fastq
/home/user/RNA-seq/mycelium_reads2.fastq
/home/user/RNA-seq/fruitingbody_reads1.fastq
/home/user/RNA-seq/fruitingbody_reads2.fastq

2. 数据的预处理

2.1. 去除N的比例大于5%的reads;去除低质量reads(质量值Q≤20的碱基数占整个read的50%以上);
2.2. 根据FastQC对上述过滤后的reads的质量检测,去除reads首尾各10bp的碱基,得到的预处理数据为:

/home/user/RNA-seq/clean_reads/mycelium_reads1.fastq
/home/user/RNA-seq/clean_reads/mycelium_reads2.fastq
/home/user/RNA-seq/clean_reads/fruitingbody_reads1.fastq
/home/user/RNA-seq/clean_reads/fruitingbody_reads2.fastq

3. 使用Trinity和TGICL进行转录组的组装

3.1. 对mycelium数据和fruitingbody数据分别进行转录组的组装

$ pwd
/home/user/RNA-seq/

$ mkdir assembly
$ cd assembly

$ Trinity.pl --jaccard_clip --seqType fq --JM 50G --SS_lib_type FR --CPU 24 --inchworm_cpu 24 --bflyCPU 24 --group_pairs_distance 500 -min_contig_length 200 --output mycelium_contig --left /home/user/RNA-seq/clean_reads/mycelium_reads1.fastq --right /home/user/RNA-seq/clean_reads/mycelium_reads2.fastq
$ Trinity.pl --jaccard_clip --seqType fq --JM 50G --SS_lib_type FR --CPU 24 --inchworm_cpu 24 --bflyCPU 24 --group_pairs_distance 500 -min_contig_length 200 --output fruitingbody_contig --left /home/user/RNA-seq/clean_reads/fruitingbody_reads1.fastq --right /home/user/RNA-seq/clean_reads/fruitingbody_reads2.fastq

当然,需要将生成的两个转录组的Trinity.fasta序列按长度进行排序;统一更改的fasta
头名称;更改fasta文件名

$ cp mycelium_contig/Trinity.fasta mycelium_contigs.fasta
$ cp fruitingbody_contig/Trinity.fasta fruitingbody_contigs.fasta

3.2. 使用TGICL将两个转录组序列合并

$ pwd
/home/user/RNA-seq/assembly

$ mkdir all_tissue_contig
$ cd all_tissue_contig

$ cat ../mycelium_contigs.fasta ../fruitingbody_contigs.fasta > all.contigs.fasta
$ tgicl -F all.contigs.fasta

tgicl生成了两个有用的文件: asm_1/contigs  和 all.contigs.fasta.single
tons。其中前者是聚类后的contigs结果;后者是没有聚类的单独的contigs的序列名,需
要分别到../mycelium_contigs.fasta 和 ../fruitingbody_contigs.fasta文
件中提取出相应的序列: all.contigs.fasta.singletons.mycelium.fasta 和 
all.contigs.fasta.singletons.fruitingbody.fasta

$ cat asm_1/contigs all.contigs.fasta.singletons.mycelium.fasta all.contigs.fasta.singletons.fruitingbody.fasta > all_contigs.fasta

在对all_contigs.fasta进行fasta头的重命名,并将序列按长度排序;同时要得到all_
contigs.fasta中的序列和mycelium_contigs.fasta,fruitingbody_contigs.
fasta中序列的对应关系。

$ cp all_contigs.fasta ../

3.3. 至此得出转录组的组装结果:

/home/user/RNA-seq/assembly/all_contigs.fasta

4. 使用cufflinks来分析差异表达基因

4.1 使用tophat来将预处理后的reads比对到转录组序列上

$ pwd
/home/user/RNA-seq/

$ mkdir cufflinks
$ cd cufflinks

$ bowtie2-build ../all_contigs.fasta all_contigs

$ tophat -o tophat_out_mycelium -r 60 --mate-std-dev 80 -p 24 --library-type fr-unstranded all.contigs /home/user/RNA-seq/clean_reads/mycelium_reads1.fastq /home/user/RNA-seq/clean_reads/mycelium_reads2.fastq
$ tophat -o tophat_out_fruitingbody -r 60 --mate-std-dev 80 -p 24 --library-type fr-unstranded all.contigs /home/user/RNA-seq/clean_reads/fruitingbody_reads1.fastq /home/user/RNA-seq/clean_reads/fruitingbody_reads2.fastq

4.2 自制一个transcripts.gtf文件
由于cuffdiff运行需要一个参考序列的transcripts.gtf文件: 该文件有9列,使用tab分隔;使exon的范围为整个contig。其格式如:

AA.auricula_all_contig_1     chenlianfu  exon  1  9401  .  .  .  gene_id "A.auricula_all_contig_1"; transcript_id "A.auricula_all_contig_1";
A.auricula_all_contig_10     chenlianfu  exon  1  4464  .  .  .  gene_id "A.auricula_all_contig_10"; transcript_id "A.auricula_all_contig_10";
A.auricula_all_contig_100    chenlianfu  exon  1  3090  .  .  .  gene_id "A.auricula_all_contig_100"; transcript_id "A.auricula_all_contig_100";
A.auricula_all_contig_1000   chenlianfu  exon  1  1768  .  .  .  gene_id "A.auricula_all_contig_1000"; transcript_id "A.auricula_all_contig_1000";
A.auricula_all_contig_10000  chenlianfu  exon  1  586   .  .  .  gene_id "A.auricula_all_contig_10000"; transcript_id "A.auricula_all_contig_10000"; 
A.auricula_all_contig_10001  chenlianfu  exon  1  586   .  .  .  gene_id "A.auricula_all_contig_10001"; transcript_id "A.auricula_all_contig_10001";

4.3 使用cuffdiff来分析转录子的表达量和差异表达基因

$ pwd
/home/user/RNA-seq/cufflinks

$ cuffdiff -L mycelium,fruitingbody --library-type fr-unstranded -p 8 -o cuffdiff ./transcriptome.gtf ./tophat_out_mycelium/accepted_hits.bam ./tophat_out_fruitingbody/accepted_hits.bam

至此得出转录子的表达量数据和差异表达分析

/home/user/RNA-seq/cufflinks/cuffdiff/gene_exp.diff

Tophat的安装与使用

一. Tophat简介

Tophat使用RNA-seq的reads数据来寻找基因的剪切点(splice junction)。该软件调用Bowtie,或Bowtie2来将reads比对到参考基因组上,分析比对结果,从而寻找出外显子之间的结合位点。

二. Tophat安装

直接下载适合于Linux x86_64的二进制文件,解压缩即可使用。

$ wget http://tophat.cbcb.umd.edu/downloads/tophat-2.0.8b.Linux_x86_64.tar.gz
$ tar zxf tophat-2.0.8b.Linux_x86_64.tar.gz

前提条件当然要安装Bowtie, Bowtie2, SAM tools, Boost C++ libraries等。

三. Tophat的使用参数

使用Tohat时,bowtie2(或bowtie,下同), bowtie2-align, bowtie2-inspect, bowtie2-build 和 samtools 必须要在系统路径中。

1. 用法

$ tophat [options]* <index_base> <reads1_1[,...,readsN_1]> <reads1_2[,...,readsN_2]>
可以看出,tophat必须要的条件是比对的index数据库,以及要比对的reads。可以为多个
paired-end reads数据以逗号分开。

值得注意的:Tophat能比对的最大reads为1024bp; 能比对paired-end reads; 不能将多种不同类型的reads混合起来进行比对,这样会给出不好的结果。

如果有多种不同类型的reads进行比对,则可以:

首先,对一种类型的reads使用合适的参数运行tophat;
接着,使用bed_to_juncs将前一次的运行结果junctions.bed转换成下一次运行tophat
所的-j参数所需的junction文件;
最后,再一次使用-j参数运行tophat。

2. 常用一般参数

-h | --help
-v | --version

-N | --read-mismatches  default: 2
    丢弃不匹配碱基数超过该数目的比对结果

--read-gap-length  default: 2
    丢弃gap总长度超过该数目的比对结果

--read-edit-dist  default: 2
    丢弃read的edit distance大于该值的比对结果

--read-realign-edit-dist <int> default: "read-edit-dist" + 1
    一些跨越多个exons的reads可能会被错误地比对到geneome上。Tophat有多个比对
步骤,每个比对步骤过后,比对结果中包含了edit distance的值。该参数能让Tophat对
那些edit distance的值 >= 该参数的reads重新进行比对。若设置该参数值为0,则每个
read在多个比对步骤中每次都要进行比对。这样会加大地增加比对精确性和运行时间。默认下
该参数比上一个参数的值大,则表示对reads进行重新比对。

--bowtie1  default: bowtie2
    使用Bowtie1来代替Bowtie2进行比对。特别是使用colorspace reads时,因为只
有Bowtie1支持,而Bowtie2不支持。

-o | --output <string>  default: ./tophat_out
    输出的文件夹路径

-r | --mate-inner-dist <int>  default: 50
    成对的reads之间的平均inner距离。例如:fragments长度300bp,reads长度50bp
, 则其inner距离为200bp,该值该设为200。

--mate-std-dev <int>  default:20
    inner距离的标准偏差。

-a | --min-anchor-length <int>  default: 8
    read的锚定长度:该参数能设定的最小值为3;锚定在junction两边的reads长度只
有都大于此值,才能用于junction的验证。

-m | --splice-mismatches <int>  default: 0
    对于一个剪切比对,其在锚定区能出现的最大的不匹配碱基数。

-i | --min-intron-length <int>  default:70
    最小的intron长度。Tophat会忽略比该长度要小的donor/acceptor pairs,认
为该区属于exon。

--I | --max-intron-length <int>  default:500000
    最大的intron长度。Tophat会忽略长度大于该值的donor/acceptor pairs,除
非有long read支持。

--max-insertion-length <int>  defautl: 3
    最大的插入长度

--max-deletion-length <int>  default: 3
    最大的缺失长度

--solexa-quals
    fastq文件使用Solexa的碱基质量格式

--solexa1.3-quals | --phred64-quals
    使用Illumina GA pipeline version 1.3的碱基质量格式,即Phred64.

-Q | --quals
    说明是使用单独的碱基质量文件

--inter-quals
    有空格隔开的整数值来代表碱基质量。当使用 -C 参数时,该参数为默认参数。

-C | --color
    Colorspace reads。使用这一种reads的时候命令如下:
$ tophat --color --quals --bowtie1 [other options]* <colorspac
e_index_base> <reads1_1[,...,readsN_1]> <reads2_1[,...,readN_2]>
 <quals1_1[,...,qualsN_1]> <quals1_2[,...,qualsN_2]>

-p | --num-threads <int>  default: 1
    比对reads的线程数

-g | --max-multihits <int>  default: 20
    对于一个reads,可能会有多个比对结果,但tophat根据比对得分,最多保留的比对结
果数目。如果没有 --report-secondary-alignments 参数,则只会报告出最佳的比对
结果。若最佳比对结果数目超过该参数值,则只随机报告出该数目的最佳比对结果;若有 --
report-secondary-alignments 参数,则按得分顺序报告出比对结果,直至达到默认
的数目为止。

--report-secondary-alignments
    是否报告additional or secondary alignments(基于比对分值AS来确定的)。

--no-discordant
    对于paired reads,仅仅报告concordant mappings。

--no-mixed
    对于paired reads,只报告concordant mappings 和 discordant mappi
ngs。默认上,是所有的比对结果都报告。

--no-coverage-search
    取消以覆盖度为基础来搜寻junctions,和下一个参数对立,该参数为默认参数。
--coverage-search
    确定以覆盖度为基础来搜寻junctions。该参数能增大敏感性。

--microexon-search
    使用该参数,pipeline会尝试寻找micro-exons。仅仅在reads长度>=50bp时有效。

--library-type
    Tophat处理的reads具有链特异性。比对结果中将会有个XS标签。一般Illumina数
据的library-type为 fr-unstranded。

3. 高级参数

 --keep-tmp
    保留中间文件和临时文件,对于debug有用

--keep-fasta-order
    对比对结果按基因组fasta文件进行排序。该参数会使输出的SAM/BAM文件和tophat的
1.41或以前版本不兼容

--no-sort-bam
    输出的BAM文件不是coordinate-sorted.

--no-convert-bam
    不要转换成bam格式。输出结果为sam格式。

-R | --resume <string>
    从最末尾的成功完成点处,接着运行Tophat。使用方法为:
$ tophat -R tophat_out

-z | --zpacker  default:gzip
    用来对临时文件进行压缩的的压缩程序

4. Bowtie2的特别参数

使用tophat2的时候,其中的一些参数传递为bowtie2的参数,这些参数都以’b2′开头。其实,这些参数使用默认的即可。

end-to-end模式(Tophat2不能使用local alignment):
--b2-very-fast
--b2-fast
--b2-sensitive
--b2-very-sensitive

比对参数:
--b2-N  default: 0
--b2-L  default: 20
--b2-i  default: S,1,1.25
--b2-n-ceil  default: L,0,0.15
--b2-gbar  defaut: 4

得分参数:
--b2-mp  default: 6,2
--b2-np  default: 1
--b2-rdg  default: 5,3
--b2-rfg  default: 5,3
--b2-score-min  default: L,-0.6,-0.6

Effort参数
--b2-D  default: 15
--b2-R  default: 2

5. 融合转录子mapping

如果设定 –fusion-search 参数,则有些reads能比对到潜在的融合转录子(fusion transcripts)上。额外融合信息保存在 fusions.out 中。

--fusion-search 
    开启融合转录子的比对
--fusion-anchor-length  default: 20
    read比对到融合子的两边,每以边至少匹配的碱基数。

6. 提供的转录子的结构注释数据

值得注意的提供的GTF文中中的染色体名称和Bowtie index中的一致。这些名称是区分大小写的。

-j | --raw-juncs <.juncs file>
    提供junctions文件。该文件可以使用tophat同一目录下的程序bed_to_juncs程序
来处理tophat的结果文件junctions.bed生成。
$ bed_to_juncs <junctions.bed>
    junctions文件是tab分隔的文件,内容为:
<chrom> <leftgt> <rigth> <+/->
其中left和right数值是0-based的junction两端的值。

--no-novel-juncs
只搜寻和GFF或junctions文件中提供的junctions想匹配的reads。如果没有 -G 或 -j
 参数,则该参数无效。

-G | --GTF <GTF/GFF3 file>
提供基因模型的注释文件,GTF 2.2 或者 GFF 3 格式的文件。如果设置了该参数,Tophat
则先提取出转录子序列,然后使用Bowtie2将reads比对到提取的转录组中;只有不能比对上
的reads再比对到genome;比对上的reads再打断转变成genomic mappings;再融合新
的mappings和junctions作为最后的输出。
值得注意的是GTF/GFF文件代表chromosome和contig的第一列要和bowtie index中的
参考序列名一致。 `$ bowtie-inspect --names your_index` 命令可以获得bowt
ie的index。

--transcriptome-index <dir/prefix>
是使用了 -G 参数后,Tophat提取转录子序列,然后使用bowtie2-build来建立index,
这个过程会消耗不少时间。于是,使用该参数,会将index文件生成到指定文件夹。则后续的
运用同样的index则不再需要额外耗时了。

7. 提供insertions/deletions

以下参数是使用RNA-seq数据来验证indels。

--insertions | --deletions <.juncs file>
    juncs文件例子:
chr1 20564 20567
0-based数值。表示有20565和20566这2个碱基缺失
chr1 17491 17491 CA
表示在17491处插入了2个碱基CA

--no-novel-indels
    仅仅只搜寻在已给的位点的reads。

四. Tophat的输出结果

主要的结果文件是:
1. accepted_hits.bam
2. junctions.bed UCSC BED格式
3. insertions.bed 和 deletions.bed

五. 思考题

对一物种的两个样本A和B使用Illumina Hiseq2000分别进行了转录组测序,得到了结果文件A.reads1_1.fastq, A.reads1_2.fastq, B.reads1_1.fastq 和 B.reads1_2fastq。测序文库的插入片段长度为200bp,reads长度为90bp。物种的基因组文件为species.fasta。请用Tophat分析该物种的转录结合位点,indel信息?

$ bowtie2-build species.fastq species
$ tophat \
  --read-realign-edit-dist 0 \
  -o ./tophat_out \
  -r 20 \
  --mate-std-dev 20 \
  --coverage-search \
  --microexon-search \
  -p 24 \
  --library-type fr-unstranded \
  species \
  A.reads1_1.fastq,B.reads1_1.fastq A.reads1_2.fastq B.reads1_2fastq

Bowtie2用法祥解

参考自:http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml

懒人必看

对参考序列构建index
$ bowtie2-build genome.fasta index

尝试使用前10000个reads进行比对
$ bowtie2 -u 10000 -p 8 -x index -1 reads1.fq -2 reads2.fq -S out.sam

使用8个线程进行比对
$ bowtie2 -p 8 -x index -1 reads1.fq -2 reads2.fq -S out.sam

比对的sam结果中添加了read group信息
$ bowtie2 -p 8 --rg-id sample01 --rg "PL:ILLUMINA" --rg "SM:sample01" -x index -1 reads1.fq -2 reads2.fq -S out.sam 

常用的参数进行比对,可以更改其中的参数获得更好的结果
$ bowtie2 -q --phred33 --sensitive --end-to-end -I 0 -X 500 --fr --un unpaired --al aligned --un-conc unconc --al-conc alconc -p 6 --reorder -x <bt2-idx> {-1 <m1gt; -2 <m2> | -U <r>} -S [<hit>]

用法:

bowtie2 [options]* -x <bt2-idx> {-1 <m1> -2 <m2> | -U <r>} -S [<hit>] 

bowtie2-build用法

bowtie2-build默认情况下将fasta文件换成index的数据库。
$ bowtie2-build <fasta文件> <要生存的索引文件前缀名>

必须参数:

-x <bt2-idx> bowtie2-build所生成的索引文件的前缀。首先 在当前目录搜寻,然后
在环境变量 BOWTIE2_INDEXES 中制定的文件夹中搜寻。

-1 <m1> 双末端测寻对应的文件1。可以为多个文件,并用逗号分开;多个文件必须和 -2 
<m2> 中制定的文件一一对应。比如:"-1 flyA_1.fq,flyB_1.fq -2 flyA_2.fq,flyB
_2.fq". 测序文件中的reads的长度可以不一样。

-2 <m2> 双末端测寻对应的文件2.

-U <r> 非双末端测寻对应的文件。可以为多个文件,并用逗号分开。测序文件中的reads
长度可以不一样。

-S <hit> 所生成的SAM格式的文件前缀。默认是输入到标准输出。

以下是可选参数:

输入参数

-q 输入的文件为FASTQ格式文件,此项为默认值。

-qseq 输入的文件为QSEQ格式文件。

-f 输入的文件为FASTA格式文件。选择此项时,表示--ignore-quals也被选择了。

-r 输入的文件中,每一行代表一条序列,没有序列名和测序质量等。选择此项时,表示--
ignore-quals也被选择了。

-c 后直接为比对的reads序列,而不是包含序列的文件名。序列间用逗号隔开。选择此项时,
表示—ignore-quals也被选择了。

-s/--skip <int> inputreads中,跳过前<int>reads或者pairs

-u/--qupto <int> 只比对前<int>reads或者pairs(在跳过前<int>reads或者
pairs后)。Default: no limit.

-5/--trim5 <int> 剪掉5'<int>长度的碱基,再用于比对。(default: 0).

-3/--trim3 <int> 剪掉3'<int>长度的碱基,再用于比对。(default: 0).

--phred33 输入的碱基质量等于ASCII码值加上33. 在最近的illumina pipiline
得以运用。最低碱基质量是“#”。

--phred64 输入的碱基质量等于ASCII码值加上64.最低碱基质量是“B”。

--solexa-quals Solexa的碱基质量转换为Phred。在老的GA Pipeline版本中得以
运用。Default: off.
 --int-quals 输入文件中的碱基质量为用“ ”分隔的数值,而不是ASCII码。比如 40 40 
30 40...Default: off.

 –end-to-end模式下的预设参数

--very-fast Same as: -D 5 -R 1 -N 0 -L 22 -i S,0,2.50 
--fast Same as: -D 10 -R 2 -N 0 -L 22 -i S,0,2.50 
--sensitive Same as: -D 15 -R 2 -N 0 -L 22 -i S,1,1.15 (default in --end-to-end mode) 
--very-sensitive Same as: -D 20 -R 3 -N 0 -L 20 -i S,1,0.50

–loca模式下的预设参数

--very-fast-local Same as: -D 5 -R 1 -N 0 -L 25 -i S,1,2.00 
--fast-local Same as: -D 10 -R 2 -N 0 -L 22 -i S,1,1.75 
--sensitive-local Same as: -D 15 -R 2 -N 0 -L 20 -i S,1,0.75 (default in --local mode) 
--very-sensitive-local Same as: -D 20 -R 3 -N 0 -L 20 -i S,1,0.50

 比对参数:

-N <int> 进行种子比对时允许的mismatch. 可以设为0或者1. Default: 0.

-L <int> 设定种子的长度.

************************************************************
功能选项
给bowtie的一些参数设定值的时候,使用一个计算公式代替,于是值的大小与比对序列的长
度成一定关系。<func>有三部分组成: (a)计算方法, 包括常数(C),线性(L),平方根(S)
自然对数(G); (b)一个常数; (c)一个系数. 
例如: 
<func> L,-0.4,-0.6 则计算公式为: f(x) = -0.4 + -0.6 * x
<func> G,1,5.4 则计算公式为: f(x) = 1.0 + 5.4 * ln(x)
************************************************************

-i <func> 设定两个相邻种子间所间距的碱基数。
************************************************************
例如:如果read的长度为30, 种子的长度为10, 相邻种子的间距为6,则提取出的种子如下
所示:
Read:      TAGCTACGCTCTACGCTATCATGCATAAAC
Seed 1 fw: TAGCTACGCT
Seed 1 rc: AGCGTAGCTA
Seed 2 fw:       CGCTCTACGC
Seed 2 rc:       GCGTAGAGCG
Seed 3 fw:             ACGCTATCAT
Seed 3 rc:             ATGATAGCGT
Seed 4 fw:                   TCATGCATAA
Seed 4 rc:                   TTATGCATGA 
************************************************************
 --end-to-end模式中默认值为”-i S,1,1.15”.即表示f(x) = 1 + 1.15 * 
sqrt(x). 如果read长度为100, 则相邻种子的间距为12.

--n-ceil <func> 设定read中允许含有不确定碱基(GTAC,通常为N)的最大数目. 
Default: L,0,0.15. 计算公式为: f(x) = 0 + 0.15 * x, 表示长度为100read
最多运行存在15个不确定碱基. 一旦不确定碱基数超过15, 则该条read会被过滤掉.

--dpad <int> Default: 15.

--gbar <int> read头尾<int>个碱基内不允许gap. Default: 4.
 --ignore-quals 计算错配罚分的时候不考虑碱基质量. 当输入序列的模式为-f, -r 
-c的时候, 该设置自动成为默认设置.

--nofw/--norc –nofw设定read不和前导链(forward reference strand)进行比对;
 --norc设定不和后随链(reverse-complement reference strand)进行比对. 
Default: both strands enabled.

--end-to-end 比对是将整个read和参考序列进行比对. 该模式--ma的值为0. 该模式为
默认模式, --local模式冲突.

--local 该模式下对read进行局部比对, 从而, read两端的一些碱基不比对,从而使比
对得分满足要求. 该模式下 –ma默认为2.

 得分罚分参数

--ma <int> 设定匹配得分. --local模式下每个read上碱基和参考序列上碱基匹配, 
<int>. 在—end-to-end模式中无效. Default: 2.

--mp MX,MN 设定错配罚分. 其中MX为所罚最高分, MN为所罚最低分. 默认设置下罚分与
碱基质量相关. 罚分遵循的公式为: MN + floor( (MX-MN)(MIN(Q, 40.0)/40.0) ). 
其中Q为碱基的质量值. 如果设置了—ignore-qual参数, 则错配总是罚最高分. Default: 
MX = 6, MN = 2.

--np <int> 当匹配位点中read, reference上有不确定碱基(比如N)时所设定的罚分值.
Default: 1.

--rdg <int1>,<int2> 设置在read上打开gap 罚分<int1>, 延长gap罚分<int2>. 
Default: 5, 3.

--rfg <int1>,<int2> 设置在reference上打开gap 罚分<int1>, 延长gap罚分
<int2>. Default: 5, 3.

--score-min <func> 设定成为有效比对的最小分值. 在—end-to-end模式下默认值为:
L,-0.6,-0.6; --local模式下默认值为: G,20,8.

报告参数

-k <int> 默认设置下, bowtie2搜索出了一个read不同的比对结果, 并报告其中最好的
比对结果(如果好几个最好的比对结果得分一致, 则随机挑选出其中一个). 而在该模式下, 
bowtie2最多搜索出一个read <int>个比对结果, 并将这些结果按得分降序报告出来.

-a -k参数一样, 不过不限制搜索的结果数目. 并将所有的比对结果都按降序报告出来. 
此参数和-k参数冲突. 值得注意的是: 如果基因组含有很多重复序列时, 该参数会导致程序
运行极其缓慢.

Effort 参数

-D <int> 比对时, 将一个种子延长后得到比对结果, 如果不产生更好的或次好的比对结果, 
则该次比对失败. 当失败次数连续达到<int>次后, 则该条read比对结束. Bowtie2才会
继续进行下去. Default: 15. 当具有-k-a参数, 则该参数所产生的限制会自动调整.

-R <int> 如果一个read所生成的种子在参考序列上匹配位点过多. 当每个种子平均匹配超
300个位置, 则通过一个不同的偏移来重新生成种子进行比对. <int>则是重新生成种子
的次数. Default: 2.

Paired-end 参数

-I/--minins <int> 设定最小的插入片段长度. Default: 0.

-X/--maxins <int> 设定最长的插入片段长度. Default: 500.

--fr/--rf/--ff 设定上下游reads和前导链paired-end比对的方向. --fr: 匹配时,
read15'端上游, 和前导链一致, read23'下游, 和前导链反向互补. 或者read2
上游, read1在下游反向互补; --rf: read15'端上游, 和前导链反向互补, read2
3'端下游, 和前导链一致; --ff: 两条reads都和前导链一致. Default: --fr. 默认
设置适合于Illuminapaired-end测序数据; 若是mate-paired, 则要选择—rf参数.

--no-mixed 默认设置下, 一对reads不能成对比对到参考序列上, 则单独对每个read
行比对. 该选项则阻止此行为.

--no-discordant 默认设置下, 一对reads不能和谐比对(concordant alignment,
即满足-I, -X, --fr/--rf/--ff的条件)到参考序列上, 则搜寻其不和谐比对(discon
cordant alignment, 即两条reads都能独一无二地比对到参考序列上, 但是不满足-I,
-X,--fr/--rf/--ff的条件). 该选项阻止此行为.

--dovetail read1read2的关系为dovetail的时候,该状况算为和谐比对. 默认情况
dovetail不算和谐比对.

--no-contain read1read2的关系为包含的时候, 该状况不算为和谐比对. 默认情况
下包含关系算为和谐比对.

--no-overlap read1read2的关系为有重叠的时候, 该状况不算为和谐比对. 默认情
况下两个reads重叠算为和谐比对.

输出参数

-t/--time  --un <path> unpaired reads写入到<path>.
--un-gz <path> unpaired reads写入到<path>, gzip压缩.
--un-bz2 <path> unpaired reads写入到<path>, bz2压缩.

--al <path> 将至少能比对1次以上的unpaired reads写入<path>.
--al-gz <path> ... ,gzip压缩.
--al-bz2 <path> ... ,bz2压缩.

--un-conc <path> 将不能和谐比对的paired-end reads写入<path>.
--un-conc-gz <path> ... ,gzip压缩.
--un-conc-bz2 <path> ... ,bz2压缩.

--al-conc <path> 将至少能和谐比对一次以上的paired-end reads写入<path>.
--al-conc-gz <path> ... ,gzip压缩.
--al-conc-bz2 <path>... ,bz2压缩.

--quiet 安静模式,除了比对错误和一些严重的错误, 不在屏幕上输出任何东西.

--met-file <path> bowtie2的检测信息(metrics)写入文件<path>. 用于debug. 
Default: metrics disabled.

--met-stderr <path> bowtie2的检测信息(metrics)写入标准错误文件句柄. 和上
一个选项不冲突. Default: metrics disabled.

--met <int> 每隔<int>秒写入一次metrics记录. Default: 1.

 Sam 参数

--no-unal 不记录没比对上的reads.

--no-hd 不记录SAM header lines (@开头).

--no-sq 不记录@SQSAM header lines.

--rg-id <text> 设定read group ID为text。在SAM文件的头中增加一行@RG,在输出的SAM
文件中添加Tag "RG:Z:text"。

--rg <text> 使用text作为@RG的一列,比如"SM:Pool1"。在@RG中加入多列,则多次使用
该参数即可。在进行Variant calling的过程中需要@RG头,SM信息和Tag RG。

性能参数

-o/--offrate <int> 无视indexoffrate, <int>取代之. Index默认的<int> 
值为5. <int>值必须大于indexoffrate, 同时<int>越大, 耗时越长,耗内存越少.

-p/--threads NTHREADS 设置线程数. Default: 1

--reorder 多线程运算时, 比对结果在顺序上会和文件中reads的顺序不一致, 使用该选
, 则使其一致.

--mm 使用内存定位的I/O来载入index, 而不是常规的文件I/O. 从而使多个bowtie
序共用内存中同样的index, 节约内存消耗.

 其它参数:

--qc-filter 滤除QSEQ fileter filed为非0reads. 仅当有—qseq选项时有效. 
Default: off. 

--seed <int> 使用<int>作为随机数产生的种子. Default: 0.

--version 打印程序版本并退出

-h/--help 打印用法信息并推出