参考自：http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml

懒人必看

对参考序列构建index
$ bowtie2-build genome.fasta index

尝试使用前10000个reads进行比对
$ bowtie2 -u 10000 -p 8 -x index -1 reads1.fq -2 reads2.fq -S out.sam

使用8个线程进行比对
$ bowtie2 -p 8 -x index -1 reads1.fq -2 reads2.fq -S out.sam

比对的sam结果中添加了read group信息
$ bowtie2 -p 8 --rg-id sample01 --rg "PL:ILLUMINA" --rg "SM:sample01" -x index -1 reads1.fq -2 reads2.fq -S out.sam 

常用的参数进行比对，可以更改其中的参数获得更好的结果
$ bowtie2 -q --phred33 --sensitive --end-to-end -I 0 -X 500 --fr --un unpaired --al aligned --un-conc unconc --al-conc alconc -p 6 --reorder -x <bt2-idx> {-1 <m1gt; -2 <m2> | -U <r>} -S [<hit>]

用法：

bowtie2 [options]* -x <bt2-idx> {-1 <m1> -2 <m2> | -U <r>} -S [<hit>] 

bowtie2-build用法

bowtie2-build默认情况下将fasta文件换成index的数据库。
$ bowtie2-build <fasta文件> <要生存的索引文件前缀名>

必须参数：

-x <bt2-idx> 由bowtie2-build所生成的索引文件的前缀。首先 在当前目录搜寻，然后
在环境变量 BOWTIE2_INDEXES 中制定的文件夹中搜寻。

-1 <m1> 双末端测寻对应的文件1。可以为多个文件，并用逗号分开；多个文件必须和 -2 
<m2> 中制定的文件一一对应。比如:"-1 flyA_1.fq,flyB_1.fq -2 flyA_2.fq,flyB
_2.fq". 测序文件中的reads的长度可以不一样。

-2 <m2> 双末端测寻对应的文件2.

-U <r> 非双末端测寻对应的文件。可以为多个文件，并用逗号分开。测序文件中的reads的
长度可以不一样。

-S <hit> 所生成的SAM格式的文件前缀。默认是输入到标准输出。

以下是可选参数：

输入参数

-q 输入的文件为FASTQ格式文件，此项为默认值。

-qseq 输入的文件为QSEQ格式文件。

-f 输入的文件为FASTA格式文件。选择此项时，表示--ignore-quals也被选择了。

-r 输入的文件中，每一行代表一条序列，没有序列名和测序质量等。选择此项时，表示--
ignore-quals也被选择了。

-c 后直接为比对的reads序列，而不是包含序列的文件名。序列间用逗号隔开。选择此项时，
表示—ignore-quals也被选择了。

-s/--skip <int> input的reads中，跳过前<int>个reads或者pairs。

-u/--qupto <int> 只比对前<int>个reads或者pairs（在跳过前<int>个reads或者
pairs后）。Default: no limit.

-5/--trim5 <int> 剪掉5'端<int>长度的碱基，再用于比对。(default: 0).

-3/--trim3 <int> 剪掉3'端<int>长度的碱基，再用于比对。(default: 0).

--phred33 输入的碱基质量等于ASCII码值加上33. 在最近的illumina pipiline中
得以运用。最低碱基质量是“#”。

--phred64 输入的碱基质量等于ASCII码值加上64.最低碱基质量是“B”。

--solexa-quals 将Solexa的碱基质量转换为Phred。在老的GA Pipeline版本中得以
运用。Default: off.
 --int-quals 输入文件中的碱基质量为用“ ”分隔的数值，而不是ASCII码。比如 40 40 
30 40...。Default: off.

 –end-to-end模式下的预设参数

--very-fast Same as: -D 5 -R 1 -N 0 -L 22 -i S,0,2.50 
--fast Same as: -D 10 -R 2 -N 0 -L 22 -i S,0,2.50 
--sensitive Same as: -D 15 -R 2 -N 0 -L 22 -i S,1,1.15 (default in --end-to-end mode) 
--very-sensitive Same as: -D 20 -R 3 -N 0 -L 20 -i S,1,0.50

–loca模式下的预设参数

--very-fast-local Same as: -D 5 -R 1 -N 0 -L 25 -i S,1,2.00 
--fast-local Same as: -D 10 -R 2 -N 0 -L 22 -i S,1,1.75 
--sensitive-local Same as: -D 15 -R 2 -N 0 -L 20 -i S,1,0.75 (default in --local mode) 
--very-sensitive-local Same as: -D 20 -R 3 -N 0 -L 20 -i S,1,0.50

 比对参数：

-N <int> 进行种子比对时允许的mismatch数. 可以设为0或者1. Default: 0.

-L <int> 设定种子的长度.

************************************************************
功能选项
给bowtie的一些参数设定值的时候，使用一个计算公式代替，于是值的大小与比对序列的长
度成一定关系。<func>有三部分组成: (a)计算方法, 包括常数(C),线性(L),平方根(S)和
自然对数(G); (b)一个常数; (c)一个系数. 
例如: 
<func> 为 L,-0.4,-0.6 则计算公式为: f(x) = -0.4 + -0.6 * x
<func> 为G,1,5.4 则计算公式为: f(x) = 1.0 + 5.4 * ln(x)
************************************************************

-i <func> 设定两个相邻种子间所间距的碱基数。
************************************************************
例如：如果read的长度为30, 种子的长度为10, 相邻种子的间距为6,则提取出的种子如下
所示：
Read:      TAGCTACGCTCTACGCTATCATGCATAAAC
Seed 1 fw: TAGCTACGCT
Seed 1 rc: AGCGTAGCTA
Seed 2 fw:       CGCTCTACGC
Seed 2 rc:       GCGTAGAGCG
Seed 3 fw:             ACGCTATCAT
Seed 3 rc:             ATGATAGCGT
Seed 4 fw:                   TCATGCATAA
Seed 4 rc:                   TTATGCATGA 
************************************************************
 在--end-to-end模式中默认值为”-i S,1,1.15”.即表示f(x) = 1 + 1.15 * 
sqrt(x). 如果read长度为100, 则相邻种子的间距为12.

--n-ceil <func> 设定read中允许含有不确定碱基(非GTAC,通常为N)的最大数目. 
Default: L,0,0.15. 计算公式为: f(x) = 0 + 0.15 * x, 表示长度为100的read
最多运行存在15个不确定碱基. 一旦不确定碱基数超过15, 则该条read会被过滤掉.

--dpad <int> Default: 15.

--gbar <int> 在read头尾<int>个碱基内不允许gap. Default: 4.
 --ignore-quals 计算错配罚分的时候不考虑碱基质量. 当输入序列的模式为-f, -r 或
者-c的时候, 该设置自动成为默认设置.

--nofw/--norc –nofw设定read不和前导链(forward reference strand)进行比对;
 --norc设定不和后随链(reverse-complement reference strand)进行比对. 
Default: both strands enabled.

--end-to-end 比对是将整个read和参考序列进行比对. 该模式--ma的值为0. 该模式为
默认模式, --local模式冲突.

--local 该模式下对read进行局部比对, 从而, read两端的一些碱基不比对，从而使比
对得分满足要求. 该模式下 –ma默认为2.

 得分罚分参数

--ma <int> 设定匹配得分. --local模式下每个read上碱基和参考序列上碱基匹配, 则
加<int>分. 在—end-to-end模式中无效. Default: 2.

--mp MX,MN 设定错配罚分. 其中MX为所罚最高分, MN为所罚最低分. 默认设置下罚分与
碱基质量相关. 罚分遵循的公式为: MN + floor( (MX-MN)(MIN(Q, 40.0)/40.0) ). 
其中Q为碱基的质量值. 如果设置了—ignore-qual参数, 则错配总是罚最高分. Default: 
MX = 6, MN = 2.

--np <int> 当匹配位点中read, reference上有不确定碱基(比如N)时所设定的罚分值.
Default: 1.

--rdg <int1>,<int2> 设置在read上打开gap 罚分<int1>, 延长gap罚分<int2>. 
Default: 5, 3.

--rfg <int1>,<int2> 设置在reference上打开gap 罚分<int1>, 延长gap罚分
<int2>. Default: 5, 3.

--score-min <func> 设定成为有效比对的最小分值. 在—end-to-end模式下默认值为:
L,-0.6,-0.6; 在--local模式下默认值为: G,20,8.

报告参数

-k <int> 默认设置下, bowtie2搜索出了一个read不同的比对结果, 并报告其中最好的
比对结果(如果好几个最好的比对结果得分一致, 则随机挑选出其中一个). 而在该模式下, 
bowtie2最多搜索出一个read <int>个比对结果, 并将这些结果按得分降序报告出来.

-a 和-k参数一样, 不过不限制搜索的结果数目. 并将所有的比对结果都按降序报告出来. 
此参数和-k参数冲突. 值得注意的是: 如果基因组含有很多重复序列时, 该参数会导致程序
运行极其缓慢.

Effort 参数

-D <int> 比对时, 将一个种子延长后得到比对结果, 如果不产生更好的或次好的比对结果, 
则该次比对失败. 当失败次数连续达到<int>次后, 则该条read比对结束. Bowtie2才会
继续进行下去. Default: 15. 当具有-k或-a参数, 则该参数所产生的限制会自动调整.

-R <int> 如果一个read所生成的种子在参考序列上匹配位点过多. 当每个种子平均匹配超
过300个位置, 则通过一个不同的偏移来重新生成种子进行比对. <int>则是重新生成种子
的次数. Default: 2.

Paired-end 参数

-I/--minins <int> 设定最小的插入片段长度. Default: 0.

-X/--maxins <int> 设定最长的插入片段长度. Default: 500.

--fr/--rf/--ff 设定上下游reads和前导链paired-end比对的方向. --fr: 匹配时，
read1在5'端上游, 和前导链一致, read2在3'下游, 和前导链反向互补. 或者read2在
上游, read1在下游反向互补; --rf: read1在5'端上游, 和前导链反向互补, read2在
3'端下游, 和前导链一致; --ff: 两条reads都和前导链一致. Default: --fr. 默认
设置适合于Illumina的paired-end测序数据; 若是mate-paired, 则要选择—rf参数.

--no-mixed 默认设置下, 一对reads不能成对比对到参考序列上, 则单独对每个read进
行比对. 该选项则阻止此行为.

--no-discordant 默认设置下, 一对reads不能和谐比对(concordant alignment,
即满足-I, -X, --fr/--rf/--ff的条件)到参考序列上, 则搜寻其不和谐比对(discon
cordant alignment, 即两条reads都能独一无二地比对到参考序列上, 但是不满足-I,
-X,--fr/--rf/--ff的条件). 该选项阻止此行为.

--dovetail read1和read2的关系为dovetail的时候,该状况算为和谐比对. 默认情况
下dovetail不算和谐比对.

--no-contain read1和read2的关系为包含的时候, 该状况不算为和谐比对. 默认情况
下包含关系算为和谐比对.

--no-overlap read1和read2的关系为有重叠的时候, 该状况不算为和谐比对. 默认情
况下两个reads重叠算为和谐比对.

输出参数

-t/--time  --un <path> 将unpaired reads写入到<path>.
--un-gz <path> 将unpaired reads写入到<path>, gzip压缩.
--un-bz2 <path> 将unpaired reads写入到<path>, bz2压缩.

--al <path> 将至少能比对1次以上的unpaired reads写入<path>.
--al-gz <path> ... ,gzip压缩.
--al-bz2 <path> ... ,bz2压缩.

--un-conc <path> 将不能和谐比对的paired-end reads写入<path>.
--un-conc-gz <path> ... ,gzip压缩.
--un-conc-bz2 <path> ... ,bz2压缩.

--al-conc <path> 将至少能和谐比对一次以上的paired-end reads写入<path>.
--al-conc-gz <path> ... ,gzip压缩.
--al-conc-bz2 <path>... ,bz2压缩.

--quiet 安静模式,除了比对错误和一些严重的错误, 不在屏幕上输出任何东西.

--met-file <path> 将bowtie2的检测信息(metrics)写入文件<path>. 用于debug. 
Default: metrics disabled.

--met-stderr <path> 将bowtie2的检测信息(metrics)写入标准错误文件句柄. 和上
一个选项不冲突. Default: metrics disabled.

--met <int> 每隔<int>秒写入一次metrics记录. Default: 1.

 Sam 参数

--no-unal 不记录没比对上的reads.

--no-hd 不记录SAM header lines (以@开头).

--no-sq 不记录@SQ的SAM header lines.

--rg-id <text> 设定read group ID为text。在SAM文件的头中增加一行@RG，在输出的SAM
文件中添加Tag "RG:Z:text"。

--rg <text> 使用text作为@RG的一列，比如"SM:Pool1"。在@RG中加入多列，则多次使用
该参数即可。在进行Variant calling的过程中需要@RG头，SM信息和Tag RG。

性能参数

-o/--offrate <int> 无视index的offrate值, 以<int>取代之. Index默认的<int> 
值为5. <int>值必须大于index的offrate值, 同时<int>越大, 耗时越长，耗内存越少.

-p/--threads NTHREADS 设置线程数. Default: 1

--reorder 多线程运算时, 比对结果在顺序上会和文件中reads的顺序不一致, 使用该选
项, 则使其一致.

--mm 使用内存定位的I/O来载入index, 而不是常规的文件I/O. 从而使多个bowtie程
序共用内存中同样的index, 节约内存消耗.

 其它参数：

--qc-filter 滤除QSEQ fileter filed为非0的reads. 仅当有—qseq选项时有效. 
Default: off. 

--seed <int> 使用<int>作为随机数产生的种子. Default: 0.

--version 打印程序版本并退出

-h/--help 打印用法信息并推出