1. GBrowse的安装
GBrowse安装说明文档：http://gmod.org/wiki/GBrowse_2.0_Install_HOWTO
GBrowse的安装很少有能顺利安装成功的。需要不断的摸索，看文档，并搜索相关错误，google看别人是怎么解决的。有管一些我安装过程遇到的困难如下：
1.1 安装 io-lib和Bio-SCF, io-lib是安装Bio-SCF所必须的。在这一步容易出问题，导致无法安装。
$ wget http://downloads.sourceforge.net/project/staden/io_lib/1.13.0/io_lib-1.13.0.tar.gz
$ make -j 8
$ sudo make install
$ wget http://search.cpan.org/CPAN/authors/id/L/LD/LDS/Bio-SCF-1.03.tar.gz
$ tar zxf Bio-SCF-1.03.tar.gz
$ cd Bio-SCF-1.03
$ perl Makefile.PL
$ make
$ sudo make install
当使用CPAN安装的时候test错误，使用手工安装，不用进行test。
2. Gbrowse的配置
2.1 Gbrowse文件
安装好Gbrowse后，须知道几个主要的文件存放位置，默认如下：
GBrowse-2.54/ 解压的GBrowse安装目录，其中bin目录下有很多重要的程序，比如创建Gbrowse2的用户的程序等。
/etc/gbrowse2/ 存放Gbrowse的配置文件，有全局的配置文件 GBrowse.conf 和 自己建立的一个物种的配置文件 species.conf;
/var/www/html/gbrowse2/ 存放gbrowse2的一些网页文件，比如gbrowse2的使用教程等；
/var/www/cgi-bin/gb2/ gbrowse2的web程序可执行文件，
/var/lib/gbrowse2/ gbrowse2的数据库目录和用户目录等。需要修改数据库目录的用户拥有者，以便于导入数据。
$ sudo chown chenlianfu /var/lib/gbrowse2/databases/
2.2 /etc/gbrowse2/GBrowse.conf 几个可能需要需要定制的配置：
1. max_render_processes = 12 设置渲染需要的最大CPU线程数
2. image widths = 450 640 800 1024 1280 1440 设置基因组浏览器显示的宽度，可选的值，在perference项中进行设置时可选的值
default width = 1024 默认的值
3. show sources = 1 默认下开启下拉菜单 数据源 ，以利于转移到其它物种的基因组浏览中。
4. #include "themes/warm_colors" 基因组浏览器的3个主题，此为默认的主题。
# #include "themes/transparent_colors"
# #include "themes/solid_gray_colors"
5. default source = yeast 设置基因组浏览器中默认的物种，即http://host/cgi-bin/gb2/gbrowse/默认所访问的物种。
6. [lentinula_edodes] 设置所要建立的物种的基因组浏览器的配置文件路径
description = Lentinula edodes Genome
path = lentinula_edodes.conf
7. 在GBrowse.conf同目录下有个languages的文件夹，其中gbrowse2默认使用zh.pm模块，于是GBrowse的显示文字默认是繁体中文，可以使用其目录下的其它语言模块代替。
2.3 Data Source Sections的配置
对所需要浏览基因组的物种，则需要建立一个专门的配置文件，比如本文中的 /etc/gbrowse2/lentinula_edodes.conf 文件。
[GENERAL] 全局设置
restrict = require user chenlianfu hzaumycology 设置该基因组浏览器的访问权限，只有chenlianfu和hzaumycology能访问。使用命令gbrowse_create_account.pl来创建gbrowse用户
description = Lentinula edodes Genome Database 对数据库的描述
database = gene_Prediction_EVM 数据库的名字，这个一定要有，不然会提示错误。当然如果将只有一个数据库，并放入到GENERAL中，则不需要该项
initial landmark = scaffold_1:20000..40000 初始访问数据库时候显示的区域
default tracks = Genes_EVM 初始访问数据库时候显示的tracks
Genes_Augustus
metadata = 对数据库的一些描述
-description Lentinula edodes Genome (strain: W1-26)
-maintainer Lianfu Chen
-created 2013-05-28
-modified 2013-05-28
-authority hzaumycology
-coordinates http://www.hzaumycology.com/
-coordinates_version 1
-source Scaffold
-testrange scaffold_1:103361..105454
-species Lentinula edodes W1-26
example = scaffold_1 给出的几个例子用于选择
scaffold_1000:2164..4463
#################################
# database definitions 数据库设置。
#################################
[gene_Prediction_EVM:database] 第一个数据库。该数据库稍微特殊些，在全局中使用该数据库，需要将fasta文件和scaffold信息导入到该数据库。
db_adaptor = Bio::DB::SeqFeature::Store 数据库的读取方法
db_args = -adaptor DBI::mysql 使用mysql数据库
-dsn lentinula_edodes_EVM mysql数据库中的数据库名
-user chenlianfu mysql数据库的可写用户
-password 1234567 用户的密码
search options = default 该数据库中的搜索选项
[gene_Prediction_Augustus:database] 另外的一个数据库。将不同的基因注释放入不同的数据库，然后放入不同的tracks，有利于阅读和使用基因组。
db_adaptor = Bio::DB::SeqFeature::Store
db_args = -adaptor DBI::mysql
-dsn lentinula_edodes_Augustus
-user chenlianfu
-password 1234567
search options = default
########################
# Default glyph settings 默认的glyph设置
########################
[TRACK DEFAULTS]
glyph = generic glyph的默认类型
height = 10 glyph的高度
r = black
font2color = blue
label density = 25 当labels比该数目多的时候，则关闭labels的显示以节约空间
bump density = 100 当features的数目多于该值的时候， 则不在垂直方向上显示features，它们都被限制在了一个水平线上。
link = AUTO 点击feature的时候，链接到feature的信息文档中。
################## TRACK CONFIGURATION ####################
# the remainder of the sections configure individual tracks 设置track
###########################################################
#[Genes_EVM:overview] 将该track置于overview中，而不是detail中，此时，分类自动成为overview。好处是在整体上看到该track的特征，但是细节上就没法放大了。
#[Genes_EVM:region] 同上。
[Genes_EVM] track名
database = gene_Prediction_EVM track所用到的数据库
feature = gene track所用的feature
glyph = gene track的glyph
starnd_arrow = 1 glyph具有方向性；有些glyph内在就具有或不具方向性，设置该值则不影响。
bgcolor = peachpuff 颜色
decorate_introns = 1 intron显示方法
label_transcripts = 1
draw_translation = 1
category = Genes track所属的分类，对应着gbrowse2的“Select Tracks"的分类
label_transcripts = 1
visible = 1 初始访问数据库时候显示该tracks
key = Genes Predictions Intergrated by EVM track在浏览器中的名称
citation = EVM was used to integrate the genes prediction results of Augustus, SNAP and GeneMarkES ;PASA was used to add UTR annotations and Alternatively spliced isoforms. 该track的介绍。
[Genes_Augustus]
database = gene_Prediction_Augustus
#feature = gene:AUGUSTUS feature为gff3文件的type：source。这样做的话，就可以不必建多个mysql数据库，只需要把source设置好即可。
feature = gene
glyph = gene
bgcolor = peachpuff
decorate_introns = 1
label_transcripts = 1
draw_translation = 1
category = Genes
label_transcripts = 1
key = Genes Predicted by Augustus
3. Gbrowse的数据的导入
3.1 EVM将多个基因组预测结果进行融合后，使用PASA加上5’和3’端非翻译区后，得到最终基因组注释结果。将该文件导入到mysql数据库 gene_Prediction_EVM 中。由于该最终的注释结果文件中mRNA的Nama的值包含的字符过长，需要进行缩短，以利于阅读；该文件中的genes也需要进行排序。因此编写程序提取出适合于gbrowse导入的gff3文件。可用于导入到gbrowse2的gff3文件有一些特点：
首先，每个scaffold、chromosome或contig之前要有一行指定其feature和name。比如：
scaffold_1 . scaffold 1 322871 . . . Name=scaffold_1
这样gbrowse才能识别scaffod_1是属于scaffold类型，并有个Name是scaffold_1。才会将其在基因组浏览器中显现出来。而正常的gff3文件是没有这样一行的。
gff3文件中mRNA中的Name有些太长，在基因组浏览器中的图片中占空间太大，需要重命名得简洁些；gff3文件中intron的可以去掉；gff3文件中将feature为transcript的改变为mRNA;去掉注释行等。以上这些都会影响gborows的显示结果。
使用如下命令来将基因预测信息导入到数据库中：
$ perl parse_evm_pasa_gff3.pl LEdodesGGTrinity.gene_structures_post_PASA_updates.26576.gff3 genome.fasta 该perl程序生成适合于导入gbrowse2的gff3文件gbrowse.gff3 和 protein.fasta文件.后者为预测的蛋白组文件。
$ mysql -h localhost -u root -p
mysql > CREATE DATABASE gene_Prediction_EVM; 创建一个名为 gene_Prediction_EVM 的 mysql数据库
EOF
mysql > Bye
$ /usr/local/bin/bp_seqfeature_load.pl -c -a DBI::mysql -d gene_Prediction_EVM -u root -p password genome.fasta gbrowse.gff3
该程序能将gff3文件或fasta文件导入到数据库。其参数：
-c 清空数据库
-a 导入的数据库类型
-d mysql数据库对应的数据库名称
-u mysql数据库用户名
-p mysql数据库密码
该程序导入的时间有点长，依据feature的数目，时间长短不一。对于1.2万个基因的注释，需要约10分钟导入完成。
3.2 将Augustus的基因预测信息导入
perl prepare_Augustus_gff3_for_gbrowse2.pl Agustus.gff3 > gbrowse2.gff3
$ mysql -h localhost -u root -p
mysql > CREATE DATABASE gene_Prediction_Augustus; 创建一个名为 gene_Prediction_Augustus 的 mysql数据库
EOF
mysql > Bye
$ /usr/local/bin/bp_seqfeature_load.pl -c -a DBI::mysql -d gene_Prediction_Augustus-u root -p password genome.fasta gbrowse2.gff3
3.3 其它SNAP和PASA的基因预测信息导入和上面2中一致。不赘述。
4.1 安装Bio::DB::Sam。需要有samtools安装，并且该samtools的安装和正常安装不一样。
$ wget http://garr.dl.sourceforge.net/project/samtools/samtools/0.1.19/samtools-0.1.19.tar.bz2
$ tar jxf samtools-0.1.19.tar.bz2
$ cd samtools-0.1.19
$ perl -p -i -e 's/CFLAGS.*/CFLAGS= -g -Wall -O2 -fPIC #-m64 #-arch ppc/' Makefile
$ make -j 8
$ make clean 如果之前已经安装过samtools的话，需要修改makefile，再重新安装
$ make install
$ wget http://search.cpan.org/CPAN/authors/id/L/LD/LDS/Bio-SamTools-1.38.tar.gz
$ tar zxf Bio-SamTools-1.38.tar.gz
$ cd Bio-SamTools-1.38
$ perl Build.pl
$ ./Build
$ sudo ./Build install
4.2 修改data source配置文件
[NGS_Genome:database]
db_adaptor = Bio::DB::Sam # 数据库的读取方法
db_args = -fasta genome.fasta # 基因组的fasta文件
-bam bowtie2.bam # NGS reads的比对结果
search options = default
[GenomeReadCoverageXyplot]
feature = coverage # 基因组测序的reads的coverage
glyph = wiggle_xyplot # 使用峰图来显示reads的覆盖度
database = NGS_Genome
height = 50
fgcolor = black
bicolor_pivot = 20 # 设定一个颜色变换的coverage值
pos_color = blue # 当coverage > 以上设置的数值，s使用蓝色
neg_color = red # 当coverage < 以上设置的该数值，s使用红色
category = GenomeReads
label = 0 # labels on wiggle tracks are redundant
key = Coverage (xyplot) of Genome NGS data
[GenomeReadCoverageDensity]
feature = coverage
glyph = wiggle_density # 使用密度来显示reads的覆盖度，覆盖度越高则线条颜色越深
database = NGS_Genome
height = 30
bgcolor = blue
bicolor_pivot = 5 # 小于该值，则线条无颜色
pos_color = blue
neg_color = red
category = GenomeReads
label = 0
key = Coverage (density plot) of Genome NGS data
[GenomeReads] # reads比对到基因组的图形显示
feature = match
glyph = segments
draw_target = 1
show_mismatch = 1
mismatch_color = red
database = NGS_Genome
bgcolor = blue
fgcolor = white
height = 5
label density = 50
bump = fast
category = GenomeReads
key = Reads of Genome NGS data
[GenomeReadsPair] # reads pair比对到基因组的图形显示
feature = read_pair
glyph = segments
database = NGS_Genome
draw_target = 1
show_mismatch = 1
bgcolor = sub {
my $f = shift;
return $f->attributes('M_UNMAPPED') ? 'red' : 'green';
}
fgcolor = green
height = 3
label = sub {shift->display_name}
label density = 50
bump = fast
connector = dashed
balloon hover = sub {
my $f = shift;
return '' unless $f->type eq 'match';
return 'Read: '.$f->display_name.' : '.$f->flag_str;
}
category = GenomeReads
key = Read Pairs of Genome NGS data
[GenomeReadsMappingQuality] # reas比对到基因组的Mapping质量图，高质量使用深蓝色表示，低质量使用浅蓝色显示
feature = match
glyph = segments
draw_target = 1
show_mismatch = 1
mismatch_color = red
database = NGS_Genome
bgcolor = sub {
my $feature = shift;
my $blueness = 255 - int($feature->qual * 2.40);
my $colour = chr(35) . sprintf("%X", $blueness) .
sprintf("%X", $blueness) . "FF";
return $colour;
}
fgcolor = black
height = 5
label density = 50
bump = fast
category = GenomeReads
key = Reads' Mapping Quality of Genome NGS data
4.3 将Bam文件放置到配置文件中对应的位置。
若在track中提示该错误：
Track rending error: No index file for bam file; try opeing file with -autoindex at /usr/local/lib64/perl5/Bio/DB/Sam.pm line 2064
则表示缺少bam文件对应的index文件。该文件以bai为后缀，使用samtools生成
$ samtools index geonme.bam
