1. OrthoMCL的用途
基于序列的相似性，OrthoMCL能将一组proteins（比如全基因组的proteins）归类到ortholog groups、in-paralogs groups和co-orthologs。
2. OrthoMCL-DB
OrthoMCL-DB包含了很多proteins，这些proteins来自一些已经完全测序的真核或原核生物的基因组。OrthoMCL-DB将这些proteins进行了聚类，分成很多的ortholog groups。
2010.5.31，发布了OrthoMCL-DB第4版，包含 116,536个ortholog groups、1,270,853个proteins、88个真核生物基因组、16个古菌基因组、34个细菌基因组。
2011.5.31，发布了OrthoMCL-DB第5版，包含 124,740个ortholog groups、1,398,546 个proteins、150个基因组。
2013年末即将发布OrthoMCL-DB第6版。
3. OrthoMCL的两种使用方法
1. OrthoMCL-DB的官网已经将数据中的proteins进行了ortholog的聚类，其网站提供了一个工具，用于接收上传的基因组proteins，再将这些proteins group到相应的ortholog groups中。官网提供的工具Assign your proteins to OrthoMCL Groups用于进行分析。
2. 如果要对多个基因组的proteomes进行聚类，则可以使用OrthoMCL单机版的软件来进行运算。其用法详见：OrthoMCL的使用。
4. OrthoMCL算法
1. 将多个proteomes转换成orthomcl兼容的FASTA文件。
2. 移除低质量的序列。
3. All-versus-All BLASTP with 1e-5 cutoff。即使用这些proteomes的protein sequences构建blast数据库，再将所有的这些序列和数据库进行BLASTP比对，取evalue小于1e-5的比对结果。
4. Filter by percent match length。计算比对结果的percent match length ( 所有hsp中比对上序列的长度之和 / 两条序列中短的那条序列的长度 )。取50%的cutoff值。
5. 寻找不同物种间potential ortholog pairs(两两物种的protein序列相互是best hits)；寻找同一物种内in-paralog pairs（相互之间是better hits，即对于2个序列之中的任意一条序列，和其in-paralog序列之间的evalue值 <= 这条序列和其它物种比对的evalue值）.
6. 根据上一步结果寻找co-ortholog pairs(pairs connected by orhthology and in-paralog,并且pairs之间的evalue值低于1e-5).
7. 对所有的pairs进行E-values的Normalization，以利于下一步MCL的计算。见下一部分内容，或参考OrthoMCL Algorithm Document。
8. 将所有的ortholog,in-paralog和co-ortholog pairs，以及它们的标准化后的weight值输入到MCL程序中，来进行聚类分群。MCL documentation
5. pairs的evalue计算和标准化
pairs的evalue计算：pairs的两条序列相互blast后有两个evalue值，这两个值常常不相等。但是为了计算需要，于是pairs的之间的两个evalue值要进行一个计算，得到pairs weight，weight= ( -log10(evalue1) + -log10(evalue2) ) / 2 。
pairs的evalue的标准化：1. 对于in-paralog pairs，在某一个基因组中，取两条序列中任意一条序列有ortholog的in-paralog pairs为有效in-paralog pairs。若在这个基因组没有这样的pairs，则该基因组所有的in-paralog pairs都为有效的in-paalog pairs。最后得到所有基因组所有有效的in-paralog pairs。然后取这些有效in-paralog pairs的weight的平均值。最后，每个in-paralog pair的evalue标准化后的值为其weight除以average weight。 2. 对于ortholog或co-ortholog pairs则简单很多，求所有weight的平均值，然后使用各个pair的weight除以average weight，则将其标准化了。
6. 网络版的OrthoMCL的使用
OrthoMCL-DB已经对150个proteomes进行了OrthoMCL的分析，对orthologs进行了聚类。这个过程由于数据量大，因此，在好几百的CPU资源下也需要好几个星期才能做完。
在OrthoMCL-DB上上载 a set of proteins,服务器则会将所有上传的proteins比对到OrthoMCL-DB中所有的proteins上；选取evalue 1e-5和50% match的cutoff；然后将protein归类到其top hit所对应的protein的类上；如果top hit所对应的proteins没有group，则该protein归类到NO_GROUP。
然后，再对上一步cutoff掉的proteins来使用OrthoMCL-DB的in-paralog算法来创建in-paralogs pairs,然后再进行MCL的聚类。
使用该方法，最后将a set of proteins进行了同源基因的聚类，但是缺点如下:
1. 这种方法是单向最佳，根据protein比对的最佳结果去归类到已有的group中去。但是反过来，最佳比对结果对应的protein不一定和query protein是最佳的。这和OrthoMCL的算法是有出入的，所以该方法省了时间，但是结果和真正的结果是有一定差别的。
2. 只使用cutoff后剩下的proteins进行in-paralog分析，而没有进行所有query proteins之间的in-paralog分析。
3. 没有ortholog pairs和co-ortholog pairs的信息，没法进行单拷贝同源基因的提取与分析。
7. 本地OrthoMCL的使用
对指定的a set of proteomes进行同源基因分析，则使用本地的OrthoMCL进行分析。而官网不提供这种服务，因为消耗的计算机资源过大。
8. 注意事项
1. 序列都是使用protein序列，而不是nucleotide序列，是因为protein序列更精确。
2. proteomes中的序列要去除可变剪切，只留取alternative proteins中长度最长的。否则在有alternative proteins存在的情况下，则会造成pseudo-in-paralogs（即alternative proteins称为in-paralogs），给后续的分析造成麻烦。
3. paralog分为in-paralog和out-paralog。in-paralog是指同一个物种的paralogs的分化发生在物种分化之后，这样的话，代表in-paralogs之间的序列相似性比其orthologs的相似性要高；通过OrthoMCL的原理可以看出，很好得到分析。而out-paralog是指paralogs的分化发生在物种分化以前，这代表out-paralogs的序列之间的相似性比某一个物种的orthologs的相似性要低；这样是很不好分析的，因为不好定阈值，或者得到的结果不易得不到大众的认可；OrthoMCL也没进行out-paralog的分析；当然，也可以只将一个query proteome输入到orthomcl来进行分析，得到的是所有paralog分析结果，包含了out-paralog。