一. JELLYFISH简介
JELLYFISH是CBCB(Center for Bioinformatics and Computational Biology)的Guillaume Marçais 和 Carl Kingsford 研发的一款计数 DNA 的 k-mers 的软件。该软件运用 Hash 表来存储数据，同时能多线程运行，速度快，内存消耗小。该软件只能运行在64位的Linux系统下。其文章于2011年发表在杂志 Bioinformatics 上。
二. JELLYFISH安装
$ wget http://www.cbcb.umd.edu/software/jellyfish/jellyfish-1.1.10.tar.gz
$ tar zxvf jellyfish-1.1.10.tar.gz
$ mkdir jellyfish
$ cd jellyfish-1.1.10
$ ./configure --prefix=$PWD/../jellyfish
如果安装在当前目录中，会报错。
$ make -j 8
$ make install
三. JELLYFISH的使用
1. jellyfish的使用方法
jellyfish的功能有：kmer计数；融合二进制的Hash结果；统计Hash结果；通过Hash结果来画直方图；将Hash结果输出成文本格式；查询指定k-mer的数目。
$ jellyfish count [-o prefix] [-m merlength] [-t threads] [-s hashsize] [--both-strands] fasta [fasta ...]
$ jellyfish merge hash1 hash2 ...
$ jellyfish dump hash
$ jellyfish stats hash
$ jellyfish histo [-h high] [-l low] [-i increment] hash
$ jellyfish query hash
$ jellyfish cite
2. k-mer的计数
使用 count 的命令来执行计数功能，使用例子：
$ jellyfish count -m 16 -s 100M -t 24 -o mer_counts -c 7 input.fastq
使用fastq文件在默认参数上和fasta文件没有区别。生成的hash结果为二进制文件。
常用参数：
-m | --mer-len=<num>
使用的k-mer的长度。如果基因组大小为G，则k-mer长度选择为: k ~= log(200G)
/log(4)。
-s | --size=<num>
Hash 的大小。最好设置的值大于总的独特的(distinct)k-mer数,这样生成的文件只
有一个。若该值不够大，则会生成多个hash文件，以数字区分文件名。如果基因组大小为G，每
个reads有一个错误，总共有n条reads，则该值可以设置为『(G + n)/0.8』。该值识别
M 和 G。
-t | --threads=<num> default: 1
使用的CPU线程数
-o | --output=<string> default: mer_counts
输出的结果文件前缀
-c | --counter-len=<num> default:7
k-mer的计数结果所占的比特数,默认支持的最大数字是2^7=128。对于基因组测序覆盖
度为N，则要使设置的该值要大于N。该值越大，消耗内存越大。
-out-counter-len=<num> default:4
输出的二进制hash文件中的计数结果所占的字节数,一个字节是8比特。则默认支持的最大
数字是2^32=4.3G
-C | --both-strand default: false
对正义链和反义链都进行计数
-q | --quake default: false
quake兼容模式
--quality-start=<num> default: 64
起始碱基质量的ASCII值，默认为PHRED64
--min-quality=<num> default: 0
支持的最小的碱基质量值，低于此值的碱基将由N代替
-L | --lower-count=<num>
不输出数目低于此值的k-mer
-U | --upper-count=<num>
不输出数目高于此值的k-mer
3. 融合二进制的输出结果
上一步的输出结果为二进制文件，可能输出了多个hash文件，因此需要将这些hash文件合并成一个文件，此时用到 merge 命令。使用方法：
$ jellyfish merge -o mer_counts_merged.jf hash1 hash2 ...
常用参数：
-o | --output=<string> default: mer_counts_merged.jf
输出的结果文件
--out-counter-len=<num> default: 4
输出的二进制hash文件中的计数结果所占的字节数,一个字节是8比特。则默认支持的最大数字
是2^32=4.3G
4. 对hash结果进行统计
k-mer的结果以hash的二进制文件结果给出，需要统计出k-mer总数，特异的k-mer数目，只出现过一次的kmer数，出现了最多的k-mer的数目等信息。以stats命令来运行。使用方法：
$ jellyfish stats hash
示例结果为：
Unique: 32355544 #只出现过一次的k-mer的数目
Distinct: 88414020 #特异性的k-mer数目，包含上一个的数据
Total: 432232807 #总的k-mer数目
Max_count: 85348 #同一个k-mer出现的最多的数目
常用参数：
-L | --lower-count=<num>
不统计数目低于此值的k-mer
-U | --upper-count=<num>
不统计数目高于此值的k-mer
5. 通过Hash结果来画直方图
对k-mer的计数结果有个直观的认识，则需要统计出现了x(x=1,2,3…)次的kmer的数目y,以x，y为横纵坐标画出直方图。使用 histo 命令能给出 x 和 y 对应的值，将结果默认输出到标准输出。其使用方法为
$ jellyfish histo -l 1 -h 1000 hash
常用参数：
-l | --low=<num> default: 1
最低的 x 轴的值。同时结果会将低于此值的所有的k-mer的数目作为 (x-1) 的值。因
此该值为 2 和 1 的结果是一致的。
-h | --high=<num> default: 10000
最高的 x 轴的值。同时结果会将高于此值的所有的k-mer的数目的和作为 (x+1) 的值。
-i | --increment=<num> default: 1
x 轴取值是每隔该数值取值
-t | --threads=<num> default: 1
使用的CPU线程数
-f | --full default: false
全部的直方图
6. 将二进制Hash结果转换成文本文件
由于count命令生成的结果为二进制的，如有需要，则可以转换成可读文本文件。使用 dump 命令，使用方法：
$ jellyfish dump -c -t -U 1000 hash
常用参数：
-c | --colum default: false
生成结果为2列，第一列为k-mer序列，第二列为对应的数目。默认情况下是是fasta格
式，fasta的头为k-mer的数目，fasta的序列为k-mer的序列。
-t | --tab default: false
当 -c 参数存在时，以tab来进行分隔两行。默认是以空格来分开的。
-L | --lower-count=<num>
不输出小于该值的k-mer
-U | --upper-count=<num>
不输出高于该值的k-mer
-o | --output=<file>
输出文件的路径和名称
7. 查询指定的k-mer出现的次数
如果需要从Hash结果中查询指定的k-mer出现的次数，则要是用 query 命令。从标准输入读取k-mer的序列，从标准输出得到k-mer对应的数目。使用方法
$ jellyfish query hash
常用参数：
-C | --both-strands default: false
同时查询k-mer序列的正负链
-i | --input=<file>
输入的文件
-o | --output=<file>
输出的文件
四. 思考
1. 对Illumina paired-end测序结果进行jellyfish分析
由于paired-end序列有一定的顺序，需要将第2个文件的序列进行反向重复后，在和第一个文件的序列合到一起进行分析。可以使用Trinity中附带的软件fastool来将fastq文件转换成fasta文件，以及反向重复的转换。
$ $Trinity_Home/trinity-plugins/fastool/fastool --illumina-trinity --to-fasta reads_1.fastaq > reads_1.fasta
$ $Trinity_Home/trinity-plugins/fastool/fastool --rev --illumina-trinity --to-fasta reads_2.fastaq > reads_2.fasta
$ cat reads_1.fasta reads_2.fasta > both.fasta
$ jellyfish count ....
