1. 简介

Edena 是一个基于 overlaps–graph-based 的 de novo assembler。仅能很好地使用 Illumina 数据进行基因组组装。软件能使用 direct-reverse (paired-ends) 和 reverse-direct (mate-pairs) 的 Illumina 数据。同时要求 reads 的长度必须一致，否则所有 reads 会从 3′ 端开始截短到最短的 reads 的长度。

2. Edena 下载和安装

$ wget http://www.genomic.ch/edena/EdenaV3.131028.tar.gz
$ tar zxf EdenaV3.131028.tar.gz -C　/opt/biosoft
$ cd /opt/biosoft/EdenaV3.131028/
$ make
$ echo 'PATH=$PATH:/opt/biosoft/EdenaV3.131028/bin/' >> ~/.bashrc
$ source ~/.bashrc

3. Edena 的使用

软件直接使用 Edena 命令即可。包含两个步骤： overlapping 和 assembling。

3.1 overlapping

使用例子：

$ edena -nThreads 24 -DRpairs frag1_1.fq frag1_2.fq frag2_1.fq frag2_2.fq\
 -RDpairs jump1_1.fq jump1_2.fq jump2_1.fq jump2_2.fq

最后的结果文件为 out.ovl

3.2 Assembling

使用例子：

$ edena -e out.ovl

最终的结果文件为 out_contigs.fasta 。

1. CISA 简介

CISA (Contig Integrator for Sequence Assembly). 主要用于细菌基因组（小基因组）的整合。该软件使用简单，算法较好。
CISA 软件官网：http://sb.nhri.org.tw/CISA/en/CISA
CISA参考文献：Lin S H, Liao Y C. CISA: contig integrator for sequence assembly of bacterial genomes[J]. PloS one, 2013, 8(3): e60843.

2. CISA 算法

CISA分4步进行，如下图所示：

2.1 鉴定代表性的 contigs 并对其进行延伸

首先，将所有 Assemblies 的 contigs 进行合并，并按长度进行排序。然后调用 NUCmer 软件按从长到短的顺序对序列逐个进行基因组比对。通过此方法来得到序列在各个 Assemblies 之间的重叠状况，并将结果写入到 CISA1/explained.txt(序列重叠信息) 和 CISA1/Extend_info(序列延伸信息) 文件中。
设定的阈值为：非代表性序列与代表性序列的比对结果达到 >95% 覆盖度 和 >95% 的一致性； 或非代表性序列超出了代表性序列的两端时，比对结果 >80% 覆盖度 和 >95% 的一致性。
通过这种方法，最终得到延长的代表性序列，输出到 R1_Contigs.fa 文件中。
如图所示：对 3 个 Assemblies 进行 CISA 分析。首先找到所有 contigs 序列中最长的 contig 序列（蓝色线条表示）进行全基因组比对，得到了第 1 轮结果；然后使用剩下的序列（+号后面的序列）挑出最长的 contig 序列（蓝色线条表示），对剩下的序列使用 NUCmer 进行比对，得到第 2 轮结果； 继续使用剩下的序列挑出最长的 contig 序列（黑色线条表示），最为代表性序列进行比对；最终得到了 4 条（蓝蓝黑红）代表性序列，其中的空心椭圆和实心箭头分别代表延伸的位置和方向。

2.2 对 misassembled 的 contigs 进行去除或截断, 并对 contigs两端不确定区域进行截短

将 R1_Contigs.fa 的序列使用 NUCmer 比对到所有的 contigs 上。通过比对结果，从而对 misassembled 的 contigs 进行去除或截断, 或对 contigs两端不确定区域进行截短。
如图所示：
Phase(2)左图表示 1 条代表性序列比对到了 2 个不同的 contigs 的中间，则表明该代表性序列是错误的组装，则去除该代表性序列，同时引进相应的能比对到该代表性序列的 contigs。这些信息在 CISA2/Remove_Info 文件中。
Phase(2)右图表示 1 条代表性序列中间区域没有对应的 contigs 能匹配，则表明该序列是错误的组装，则将该区域进行去除，截断该代表性序列。有关Gaps 的信息在 CISA2/Gaps 文件中，若 Gap 长度大于其代表性序列长度的 95%，则去除该序列。
此外，对代表性序列首尾不确定性区域的信息在 CISA2/clip_info 和 CISA2/clip_out 文件中。
最终，对 misassembled 的 contigs 进行处理后，得到结果文件 R2_Contigs.fa。该文件的序列总长度偏大。

2.3 通过 Overlap 信息将 contigs 融合

如果 2 个 contigs 有 end-to-end 重叠，并且重叠区对较小 contigs 长度的比例 >30%, 则将其进行融合。使用多轮 blastn 进行迭代来融合 contigs 序列。同时也进行重复序列鉴定。
融合信息写入到每轮文件夹下的 Extend_info 文件中，同时每轮生成 temp.fa 文件，作为下一轮 blastn 的数据库构建的输入文件。
重复序列信息文件写入到每轮文件夹下的 Repeat_Region.txt 文件中。

2.4 通过 small overlap 进行 contigs 融合

上一步骤将 contigs 进行融合需要 >30% 覆盖度的 overlap，同时也鉴定了重复序列。如图所示：Phase3中，黑色与红色线条重叠区比例大，被整合到一起，该序列和其他两条蓝色序列的overlap比较small，不能进行融合。但是鉴定了其重复序列（绿色块表示）后，通过本步骤，若重复区域长度小于其 small overlap，则能将 contigs 进行融合。
此步骤和上一步骤类似，使用 blastn 进行多轮运算。同时将结果写入到每轮文件夹的 Extend_info 和 temp.fa 文件中。
最终的输出文件为 CISA.fa (由 cisa.config 配置文件指定的名称)

3. CISA 的下载与安装

$ wget http://sb.nhri.org.tw/CISA/upload/en/2014/3/CISA_20140304-05194132.tar
$ tar xf CISA_20140304-05194132.tar -C /opt/biosoft

4. CISA 的使用

4.1 创建 merge.config 配置文件

配置文件如下：

count=3 
data=abyss.fasta,title=abyss  
data=velvet.fasta,title=velvet
data=allpathslg.fasta,title=allpathslg
Master_file=merge_contigs.fa
min_length=100 (default:100)
Gap=11

4.2 Merge.py

$ /opt/biosoft/CISA1.3/Merge.py merge.config

根据上面 merge.config 配置文件信息，对 3 个 Assemblies 的 contigs 序列进行提取，并整合到 merge_contigs.fasta 文件中，同时输出各个 Assemblies 的 contigs size。

4.3 创建 cisa.config 配置文件

配置文件内容如下：

genome=47814562 (填写Assemblies中最大的 contigs size)
infile=merge_contigs.fa
outfile=cisa.contig.fa
nucmer=/opt/biosoft/MUMmer3.23/nucmer
R2_Gap=0.95 (default:0.95)
CISA=/opt/biosoft/CISA1.3
makeblastdb=/opt/biosoft/ncbi-blast/bin/makeblastdb
blastn=/opt/biosoft/ncbi-blast/bin/blastn

4.4 CISA.py

$ /opt/biosoft/CISA1.3/CISA.py cisa.config

启动主程序进行运算。基因组越大，Assemblies 数目越多，耗时越多（呈几何级数增加）。

5. 思考

CISA 应该要修改下，在第 2 步进行并行化运算，以提高速度。
可以分批进行两两融合，直到最终融合。多个两两融合进行并行化运算。
进行大基因组的融合时，CISA 不适用了。

进行多个 genome Assemblies 整合的软件有很多：GAA, GAM, GAM-NGS, GARM, CISA, minimus2, Reconciliator, MAIA 等。

我对其中的一些进行了尝试，结果下：

1. GAA：软件很快就给出了结果，但是结果明显是错的。我不知道是不是用错了，但是软件运行过程中没有报错。

2. GAM-NGS： 软件安装可能会出现一些问题。有时候能出结果， 将 master 和 slave 反过来运行却会有报错。同时使用 bowtie2 的结果作为输入会报错。该程序安装和运行太过容易出错。 没有使用 MUMer ，虽然说是能节约时间，其实生成 sorted 的 bam 文件也极为耗时的。 最后，对于我的数据，该软件的整合效果太差。

3. GARM：软件的 pipeline 明显没写好，直接报错，连使用其 example data 都狂报错。 一看下载的程序是数年前的，估计作者也没修改其程序了。

4. Reconciliator： 从其发表文章所述的链接，完全下载不到该软件。

5. MAIA： 貌似需要使用 matlab，没装 matlab 切需要用钱购买的软件，这个就麻烦了。

6. minimus2： 使用貌似需要一些其他格式的文件，貌似比较麻烦，同时基因组整合的效果听说比较差。我个人就不去费精力验证了。

7. GAM: 貌似 GAM-NGS 是在该软件基础上做的，那么这个估计也好不到哪儿去。

8. CISA： 该软件结果还不错，使用起来也非常简单。唯一的缺点是运算极度耗时，特别是运行第2步的时候，对于较大的基因组，使用此软件几乎是不可能的事情。推荐使用此软件。