一. Myrna的简介

Myrna主要用途是，使用RNA-seq数据来计算基因差异表达。
Myrna的运行步骤是：

1. 将reads进行预处理; 
2. 使用Bowtie将reads比对到参考序列上; 
3. 使用R/Bioconductor将比对结果定位到genes上; 
4. 标准化基因的比对数; 
5. 计算差异表达的统计数据; 
6. 将结果绘制出图。

Myrna有三种使用方式:

1. 在云端使用，Amazon's Elastic MapReduce service； 
2. 在 hadoop 集群上使用; 
3. 在单独的一台计算机上使用。

参考文献(2010)：Cloud-scale RNA-sequencing differential expression analysis with Myrna
只有读该文献才能全面了解Myrna.

二. Myrna的安装

1. 下载Myrna并安装

cd /home/chenlianfu/programs/
$ wget http://nchc.dl.sourceforge.net/project/bowtie-bio/myrna/1.2.0/myrna-1.2.0.zip
$ unzip myrna-1.2.0.zip

设置Myrna的环境变量MYRNA_HOME:
$ vim ~/.bashrc
export MYRNA_HOME=/home/chenlianfu/programs/myrna-1.2.0

2. 安装bowtie

安装完bowtie，再将其执行程序bin目录添加到环境变量MYRNA_BOWTIE_HOME。或者在运行程序时候使用参数 –bowtie

设置Myrna的环境变量MYRNA_BOWTIE_HOME:
$ vim ~/.bashrc
export MYRNA_BOWTIE_HOME=/home/chenlianfu/programs/bowtie-1.0.0/

3. 安装R，Bioconductor及必须的包

本软件(版本1.20)的使用必须使用R2.14，高版本的R还不兼容。故使用Myrna自带的一个脚本来下载R2.14并安装。

# R

安装R包 lmtest 和 multicore:
> install.packages("lmtest")
> install.packages("multicore")

安装Bioconductor:
> source("http://bioconductor.org/biocLite.R")
> biocLite()

安装Bioconductor包 IRanges,geneplotter,BiocGenerics 和 biomaRt:
> source("http://bioconductor.org/biocLite.R")
> biocLite("IRanges")
> biocLite("geneplotter")
> biocLite("BiocGenerics")
> biocLite("biomaRt")

设置Myrna的环境变量MYRNA_RHOME(包含bin/R和bin/Rscript):
vim ~/.bashrc
export MYRNA_RHOME=/usr/local/

4. 安装SRA toolkit

如果输入Myrna的软件是.sra格式，则需要SRA toolkit中的程序 fastq-dump 了。安装玩 SRA toolkit 后，再设置Myrna的环境变量：

$ vim ~/.bashrc
export MYRNA_SRATOOLKIT_HOME=/home/chenlianfu/programs/sratoolkit.2.3.1-centos_linux64/bin/

5. 测试本地化运行程序

使用本地化运行程序myrna_local来进行测试，通过表示安装成功。

$ $MYRNA_HOME/myrna_local --test
...
PASSED install test

6. 设置的一些环境变量

$ vim ~/.bashrc
export MYRNA_BOWTIE_HOME=/home/chenlianfu/programs/bowtie-1.0.0/
export MYRNA_HOME=/home/chenlianfu/programs/myrna-1.2.0
export MYRNA_RHOME=/usr/local/
export MYRNA_SRATOOLKIT_HOME=/home/chenlianfu/programs/sratoolkit.2.3.1-centos_linux64/bin/
export MYRNA_REFS=/home/chenlianfu/programs/myrna-1.2.0/reftools/

三. Myrna的使用

1. 本地化运行程序的使用参数：

--reference <path>
    参考序列的文件夹。该文件夹由一个参考序列jar文件使用unzip解压缩出来的，里面主
要包括两个子文件夹：1."index":里面包含bowtie-bulid产生的index文件；2."ival
s":里面包含gene的注释信息。

--input <path>
    输入的文件或文件夹路径。如果不指定--preprocess 参数，则该参数后接的是一个
文件夹，该文件夹包含了reads的预处理结果，即 --preprocess-output 的输出结果；
如果指定了 --preprocess 参数，则是一个文本文件，内容为输入的序列文件的一个清单
(Labeled manifest files)。该文件描述了输入序列文件和样本的信息。序列文件是
FASTQ或sra格式文件，FASTQ格式可以是gzip或bzip2压缩。该文件每一行代表一个测序
的结果，是以下是 unpaired reads 和 paired reads 的书写方法：
<URL>(tab)<Optional MD5>(tab)<Sample label>
<URL 1>(tab)<Optional MD5 1>(tab)<URL 2>(tab)<Optional MD5 2>(tab)<Sample label>

其中URL是测序结果文件的路径，可以是ftp站点上的文件；MD5是可选的，以利于下载文件后
用于文件的完整度检验，若不想进行检验，则设置为0；<Sample label>的写法为：
<Group ID>-<BioRep ID>-<TechRep ID>

其中，Group ID 是样品的名称；BioRep ID是生物学重复的代号；TechRep ID是技术性
重复的代号。比如：
Tumor-Subject1-Lane1
Tumor-Subject1-Lane2
Tumor-Subject2-Lane1
Tumor-Subject2-Lane2
Normal-Subject1-Lane1
Normal-Subject1-Lane2
Normal-Subject2-Lane1
Normal-Subject2-Lane2

--output <path>
    输出文件的路径。如果 --just-preprocess 参数给定，则只是对reads文件进行预
处理，给出结果。默认情况下，则是输出最终结果：一系列的表格，图和比对文件。

--intermediate <path>  default: /tmp/myrna/intermediate/<PID>
    中间结果文件存放的临时路径。如果指定了 --keep-intermediates 或 --keep-
all参数，则该文件则会一直存在。默认情况下会使用完毕后删除。

--preprocess-output <path>
    对reads进行预处理的输出路径。由于对reads的预处理会消耗很多时间，因此保留数据
的预处理结果，对再次运行程序来说，可以节约很多时间。

--keep-intermediates <path>
    保留程序运行中生成的结果文件夹和文件，默认情况下这些文件会被尽快的自动删除。

--keep-all
    保留所有的临时文件，默认情况下这些文件会被尽快的自动删除。

--cpus <int>  default: 1
   设定程序运行使用的CPU线程数。

--bowtie <path>
    设定Bowtie的路径，以运用bowtie进行比对的步骤，该参数优先于环境变量MYRNA_
BOWTIE_HOME，$MYRNA_HOME/bin的子目录，以及 PATH。

--fastq-dump <path>
    设定 SRA toolkit 中的 fastq-dump 程序的位置，优先于PAHT。

--Rhome <path>
    设定R和R/Bioconductor安装程序的位置，该目录包括 bin/R 和 bin/Rscript,
优先于环境变量MYRNA_RHOME和PATH。

2. emr, hadhoop 和 local运行的共同参数

--quality { phred33 | phred64 | solexa64 }  default: phred33
    设置输入reads的碱基质量格式。phred33:输入的碱基质量等于ASCII码值加上33;最
低碱基质量是“#”. phred64:输入的碱基质量等于ASCII码值加上64;最低碱基质量是“B”. 

--preprocess
    当 --input 的参数是一个文本文件（含有输入序列信息的清单）时，则必须加入该参数
；该参数指定出了文本文件中的序列信息来，Myrna则进行这些reads的预处理，将生成的预处
理reads结果输出到 --preprocess-output 指定的文件夹；如果不指定--preprocess
-output参数，则输出到 --intermediate 指定的文件夹。

--just-preprocess
    和 --preprocess 参数类似，但不同的是进行reads预处理后，即停止pipeline的
运行，并将结果输出到 --output指定的文件夹。

--just-align
    不将Myrna的pipeline运行到底，只是运行到比对结束，并将结果存放到 --output 
参数指定的URL.

--resume-align
    使用此命令来运行上一个命令（比对完毕）过后的阶段。 此时 --input 的参数则是上
一个命令中 --output的URL.

--bowtie-args "<args>"  default: -m 1
    设置bowtie的参数。

--discard-reads <fraction>  default: 0.0
    丢弃一定比例输的reads来进行程序的运行。比如 0.5 则代表丢弃50%的reads。该参
数应用于所有输入的reads。对于程序的调试比较有用。

--influence <int>  default: 1
    一个read的"influence"长度。和下面3个参数有关系。

--from3prime
    设定修剪过后的reads从3'端开始衡量其"influence"。此参数是默认设置，和下2个
参数是冲突的，三选一。

--from5prime
    设定修剪过后的reads从5'端开始衡量其"influence"。

--from-middle
    设定修剪过后的reads从中间开始衡量其"influence"。

--top <int>  default:50
    将genes按p值从小到大排序，Myrna将报告出前一定数目的genes的比对结果。默认是
50个genes。

--family { poisson | gaussian }  default: poisson
    设定检测gene的差异表达的统计方法。possion适合于样本<=10个；gaussian适合于
样本数>10。当然这不是硬性规定，具体还要用实验验证。当 --nulls 参数是 0 或者 没有
给出时，则使用此参数中的模型来作参数检验(parameric statistical model)，计算
出p-value.当 --nulls参数大于0，则使用permutation test来计算p-value.

--normalize { total | median | upper-quartile }
    Each count (or pooled count) is "normalized" according to a 
per-label baseline normalization factor.

--gene-footprint { union | intersect }  default: intersect
    计算比对和genges的关联时所使用的 gene footprint。intersect 和 union 
分别对应这reference文件夹中的ivals子文件夹中的ui和un文件夹；其中un对应的基因区
要比ui多，并且un的基因区包含了ui的，个人推测可能是un包含了5'端和3'端非翻译区。
union: 将一个比对结果指向某一个gene的必要条件是，read的"influence"(默认下是
从3'端开始)有一个碱基和一个gene任意的(any)transcripts重叠；intersect: 将
一个比对结果指向某一个gene的必要条件是，read的"influence"(默认下是从3'端)有一
个碱基和一个gene所有的(all)的transcripts重叠。我个人的理解，通俗来讲：以上数个
参数的目的是计算比对到gene上的reads的数目。根据比对结果，默认将reads从3'端开始
计算，如果比对上reads有一个碱基和一个gene的一个外显子重叠，则在union模式下这个
gene则可以得到一个read比对结果；而在intersect模式下，这个reads必须和该gene所
有的外显子有一个碱基的重叠，则该gene才能得到一个read比对结果。可见intersect要求
read贯穿整个gene才行能得到比对到gene的数目；因此，对于short reads进行基因表达
量计算的时候，则需要选union模式，不能选默认的模式。

--paired-ttest
    如果设定此值，则表示： 1, 是对2个样作比较； 2, 这2个样的生物学重复必须要匹
配。当该参数使用时，将对两个样作t检验。

--nulls <int>
    Set the number of null statistics generated per gene to <int>.
 A null statistic for a gene is calculated by permuting the sample
 labels for the counts and normalization factors, then re-calcula-
-ting the statistical test. 如果<int>是一个非0的数，则p-values由permu-
-tation test得出；否则，p-values由参数检验模型(parametric statistical 
model)计算出。

--truncate <int>
    将所有的reads都从3'端开始修剪，直到该参数设定的长度；小于该长度的reads依然
保留。

--truncate-discard <int>
    将所有的reads都从3'端开始修剪，直到该参数设定的长度；而小于该长度的reads全
部剔除。

--ditch-alignments
    不输出比对结果和图形结果；依然报告差异表达基因，p-values和相关的图形结果。

--discard-mate <int>
    对于 paired-end reads，去掉其中一端的序列( 1 或 2 )再来进行比对。这对于
一些数据集的比较有用，比如数据集中同时有 paired reads 和 unpaired reads时。

--pool-reps
    将所有的重复，包括生物学重复和技术性重复融合后，再进行计算统计。

--pool-tech-reps
    将技术性重复进行融合后，在进行计算统计。

--test
    搜索Myrna需要的工具(Bowtie, R/Bioconductor 和 fastq-dump），来检测
Myrna能否正确运行。

--tmpdir `<int>`  default: /tmp/Myrna/invoke.scripts
    临时文件存放的位置，是一个动态生成的脚本。

四. 个人感受

使用时，生成的结果没有rpkm值，p-value值及预期的图表结果。不知到哪儿出错了。比对的之前的过程都是正常的。同时使用sra文件时候，提示fastq-dump找不到或无法执行(实际上在–test的时候可行)。无法正常使用myrna。费心费力，不想深究了…悲剧…再去研究cufflinks去。