参考自：http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml
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对参考序列构建index
$ bowtie2-build genome.fasta index
尝试使用前10000个reads进行比对
$ bowtie2 -u 10000 -p 8 -x index -1 reads1.fq -2 reads2.fq -S out.sam
使用8个线程进行比对
$ bowtie2 -p 8 -x index -1 reads1.fq -2 reads2.fq -S out.sam
比对的sam结果中添加了read group信息
$ bowtie2 -p 8 --rg-id sample01 --rg "PL:ILLUMINA" --rg "SM:sample01" -x index -1 reads1.fq -2 reads2.fq -S out.sam
常用的参数进行比对，可以更改其中的参数获得更好的结果
$ bowtie2 -q --phred33 --sensitive --end-to-end -I 0 -X 500 --fr --un unpaired --al aligned --un-conc unconc --al-conc alconc -p 6 --reorder -x <bt2-idx> {-1 <m1gt; -2 <m2> | -U <r>} -S [<hit>]
用法：
bowtie2 [options]* -x <bt2-idx> {-1 <m1> -2 <m2> | -U <r>} -S [<hit>] bowtie2-build用法
bowtie2-build默认情况下将fasta文件换成index的数据库。 $ bowtie2-build <fasta文件> <要生存的索引文件前缀名>
必须参数：
-x <bt2-idx>由bowtie2-build所生成的索引文件的前缀。首先 在当前目录搜寻，然后在环境变量BOWTIE2_INDEXES中制定的文件夹中搜寻。-1 <m1>双末端测寻对应的文件1。可以为多个文件，并用逗号分开；多个文件必须和-2<m2>中制定的文件一一对应。比如:"-1 flyA_1.fq,flyB_1.fq -2 flyA_2.fq,flyB_2.fq".测序文件中的reads的长度可以不一样。-2 <m2>双末端测寻对应的文件2.-U <r>非双末端测寻对应的文件。可以为多个文件，并用逗号分开。测序文件中的reads的长度可以不一样。-S <hit>所生成的SAM格式的文件前缀。默认是输入到标准输出。
以下是可选参数：
输入参数
-q输入的文件为FASTQ格式文件，此项为默认值。-qseq输入的文件为QSEQ格式文件。-f输入的文件为FASTA格式文件。选择此项时，表示--ignore-quals也被选择了。-r输入的文件中，每一行代表一条序列，没有序列名和测序质量等。选择此项时，表示--ignore-quals也被选择了。-c后直接为比对的reads序列，而不是包含序列的文件名。序列间用逗号隔开。选择此项时，表示—ignore-quals也被选择了。-s/--skip <int> input的reads中，跳过前<int>个reads或者pairs。-u/--qupto <int>只比对前<int>个reads或者pairs（在跳过前<int>个reads或者pairs后）。Default: no limit.-5/--trim5 <int>剪掉5'端<int>长度的碱基，再用于比对。(default: 0).-3/--trim3 <int>剪掉3'端<int>长度的碱基，再用于比对。(default: 0).--phred33输入的碱基质量等于ASCII码值加上33.在最近的illumina pipiline中得以运用。最低碱基质量是“#”。--phred64输入的碱基质量等于ASCII码值加上64.最低碱基质量是“B”。--solexa-quals将Solexa的碱基质量转换为Phred。在老的GA Pipeline版本中得以运用。Default: off.--int-quals输入文件中的碱基质量为用“ ”分隔的数值，而不是ASCII码。比如40 4030 40...。Default: off.
–end-to-end模式下的预设参数
--very-fastSame as: -D 5 -R 1 -N 0 -L 22 -i S,0,2.50--fastSame as:-D 10 -R 2 -N 0 -L 22 -i S,0,2.50--sensitiveSame as:-D 15 -R 2 -N 0 -L 22 -i S,1,1.15(default in--end-to-endmode)--very-sensitiveSame as:-D 20 -R 3 -N 0 -L 20 -i S,1,0.50
–loca模式下的预设参数
--very-fast-localSame as: -D 5 -R 1 -N 0 -L 25 -i S,1,2.00--fast-localSame as:-D 10 -R 2 -N 0 -L 22 -i S,1,1.75--sensitive-localSame as:-D 15 -R 2 -N 0 -L 20 -i S,1,0.75(default in --local mode)--very-sensitive-localSame as:-D 20 -R 3 -N 0 -L 20 -i S,1,0.50
比对参数：
-N <int>进行种子比对时允许的mismatch数.可以设为0或者1.Default: 0.-L <int>设定种子的长度.************************************************************功能选项 给bowtie的一些参数设定值的时候，使用一个计算公式代替，于是值的大小与比对序列的长 度成一定关系。<func>有三部分组成: (a)计算方法,包括常数(C),线性(L),平方根(S)和自然对数(G); (b)一个常数; (c)一个系数.例如:<func>为L,-0.4,-0.6则计算公式为: f(x) = -0.4 + -0.6 * x<func> 为G,1,5.4则计算公式为: f(x) = 1.0 + 5.4 * ln(x)************************************************************-i <func>设定两个相邻种子间所间距的碱基数。************************************************************例如：如果read的长度为30,种子的长度为10,相邻种子的间距为6,则提取出的种子如下所示：Read: TAGCTACGCTCTACGCTATCATGCATAAACSeed 1 fw: TAGCTACGCTSeed 1 rc: AGCGTAGCTASeed 2 fw: CGCTCTACGCSeed 2 rc: GCGTAGAGCGSeed 3 fw: ACGCTATCATSeed 3 rc: ATGATAGCGTSeed 4 fw: TCATGCATAASeed 4 rc: TTATGCATGA************************************************************在--end-to-end模式中默认值为”-i S,1,1.15”.即表示f(x) = 1 + 1.15 *sqrt(x).如果read长度为100,则相邻种子的间距为12.--n-ceil <func>设定read中允许含有不确定碱基(非GTAC,通常为N)的最大数目.Default: L,0,0.15.计算公式为: f(x) = 0 + 0.15 * x,表示长度为100的read最多运行存在15个不确定碱基.一旦不确定碱基数超过15,则该条read会被过滤掉.--dpad <int> Default: 15.--gbar <int>在read头尾<int>个碱基内不允许gap. Default: 4.--ignore-quals计算错配罚分的时候不考虑碱基质量.当输入序列的模式为-f, -r或者-c的时候,该设置自动成为默认设置.--nofw/--norc –nofw设定read不和前导链(forward reference strand)进行比对;--norc设定不和后随链(reverse-complement reference strand)进行比对.Default: both strands enabled.--end-to-end比对是将整个read和参考序列进行比对.该模式--ma的值为0.该模式为默认模式, --local模式冲突.--local该模式下对read进行局部比对,从而, read两端的一些碱基不比对，从而使比对得分满足要求.该模式下 –ma默认为2.
得分罚分参数
--ma <int>设定匹配得分. --local模式下每个read上碱基和参考序列上碱基匹配,则加<int>分.在—end-to-end模式中无效. Default: 2.--mp MX,MN设定错配罚分.其中MX为所罚最高分, MN为所罚最低分.默认设置下罚分与碱基质量相关.罚分遵循的公式为: MN + floor( (MX-MN)(MIN(Q, 40.0)/40.0) ).其中Q为碱基的质量值.如果设置了—ignore-qual参数,则错配总是罚最高分. Default:MX = 6, MN = 2.--np <int>当匹配位点中read, reference上有不确定碱基(比如N)时所设定的罚分值.Default: 1.--rdg <int1>,<int2>设置在read上打开gap罚分<int1>,延长gap罚分<int2>.Default: 5, 3.--rfg <int1>,<int2>设置在reference上打开gap罚分<int1>,延长gap罚分<int2>. Default: 5, 3.--score-min <func>设定成为有效比对的最小分值.在—end-to-end模式下默认值为:L,-0.6,-0.6;在--local模式下默认值为: G,20,8.
报告参数
-k <int>默认设置下, bowtie2搜索出了一个read不同的比对结果,并报告其中最好的比对结果(如果好几个最好的比对结果得分一致,则随机挑选出其中一个).而在该模式下,bowtie2最多搜索出一个read <int>个比对结果,并将这些结果按得分降序报告出来.-a和-k参数一样,不过不限制搜索的结果数目.并将所有的比对结果都按降序报告出来.此参数和-k参数冲突.值得注意的是:如果基因组含有很多重复序列时,该参数会导致程序运行极其缓慢.
Effort 参数
-D <int>比对时,将一个种子延长后得到比对结果,如果不产生更好的或次好的比对结果,则该次比对失败.当失败次数连续达到<int>次后,则该条read比对结束. Bowtie2才会继续进行下去. Default: 15.当具有-k或-a参数,则该参数所产生的限制会自动调整.-R <int>如果一个read所生成的种子在参考序列上匹配位点过多.当每个种子平均匹配超过300个位置,则通过一个不同的偏移来重新生成种子进行比对. <int>则是重新生成种子的次数. Default: 2.
Paired-end 参数
-I/--minins <int>设定最小的插入片段长度. Default: 0.-X/--maxins <int>设定最长的插入片段长度. Default: 500.--fr/--rf/--ff设定上下游reads和前导链paired-end比对的方向. --fr:匹配时，read1在5'端上游,和前导链一致, read2在3'下游,和前导链反向互补.或者read2在上游, read1在下游反向互补; --rf: read1在5'端上游,和前导链反向互补, read2在3'端下游,和前导链一致; --ff:两条reads都和前导链一致. Default: --fr.默认设置适合于Illumina的paired-end测序数据;若是mate-paired,则要选择—rf参数.--no-mixed默认设置下,一对reads不能成对比对到参考序列上,则单独对每个read进行比对.该选项则阻止此行为.--no-discordant默认设置下,一对reads不能和谐比对(concordant alignment,即满足-I, -X, --fr/--rf/--ff的条件)到参考序列上,则搜寻其不和谐比对(disconcordant alignment,即两条reads都能独一无二地比对到参考序列上,但是不满足-I,-X,--fr/--rf/--ff的条件).该选项阻止此行为.--dovetail read1和read2的关系为dovetail的时候,该状况算为和谐比对.默认情况下dovetail不算和谐比对.--no-contain read1和read2的关系为包含的时候,该状况不算为和谐比对.默认情况下包含关系算为和谐比对.--no-overlap read1和read2的关系为有重叠的时候,该状况不算为和谐比对.默认情况下两个reads重叠算为和谐比对.
输出参数
-t/--time--un <path>将unpaired reads写入到<path>.--un-gz <path>将unpaired reads写入到<path>, gzip压缩.--un-bz2 <path>将unpaired reads写入到<path>, bz2压缩.--al <path>将至少能比对1次以上的unpaired reads写入<path>.--al-gz <path> ... ,gzip压缩.--al-bz2 <path> ... ,bz2压缩.--un-conc <path>将不能和谐比对的paired-end reads写入<path>.--un-conc-gz <path> ... ,gzip压缩.--un-conc-bz2 <path> ... ,bz2压缩.--al-conc <path>将至少能和谐比对一次以上的paired-end reads写入<path>.--al-conc-gz <path> ... ,gzip压缩.--al-conc-bz2 <path>... ,bz2压缩.--quiet 安静模式,除了比对错误和一些严重的错误, 不在屏幕上输出任何东西. --met-file <path> 将bowtie2的检测信息(metrics)写入文件<path>. 用于debug. Default: metrics disabled.--met-stderr <path>将bowtie2的检测信息(metrics)写入标准错误文件句柄.和上一个选项不冲突. Default: metrics disabled.--met <int>每隔<int>秒写入一次metrics记录. Default: 1.
Sam 参数
--no-unal不记录没比对上的reads.--no-hd不记录SAM header lines (以@开头).--no-sq不记录@SQ的SAM header lines.--rg-id <text>设定read group ID为text。在SAM文件的头中增加一行@RG，在输出的SAM 文件中添加Tag "RG:Z:text"。--rg <text>使用text作为@RG的一列，比如"SM:Pool1"。在@RG中加入多列，则多次使用 该参数即可。在进行Variant calling的过程中需要@RG头，SM信息和Tag RG。
性能参数
-o/--offrate <int>无视index的offrate值,以<int>取代之. Index默认的<int>值为5. <int>值必须大于index的offrate值,同时<int>越大,耗时越长，耗内存越少.-p/--threads NTHREADS设置线程数. Default: 1--reorder多线程运算时,比对结果在顺序上会和文件中reads的顺序不一致,使用该选项,则使其一致.--mm使用内存定位的I/O来载入index,而不是常规的文件I/O.从而使多个bowtie程序共用内存中同样的index,节约内存消耗.
其它参数：
--qc-filter滤除QSEQ fileter filed为非0的reads.仅当有—qseq选项时有效.Default: off.--seed <int>使用<int>作为随机数产生的种子. Default: 0.--version打印程序版本并退出-h/--help打印用法信息并推出